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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 마우스와 DSS의 준비
- 녹아웃(α-gustducin-/-) 마우스와 연령, 성별 및 체중이 일치하는 야생형 대조군(α-gustducin+/+) C57BL/6 마우스를 깨끗한 케이지에 개별적으로 보관하십시오.
메모: 녹아웃 마우스는 20세대 이상 동안 C57BL/6 마우스와 역교배되었으며 거의 100% C57BL/6 유전적 배경을 가지고 있습니다.
- 30g의 덱스트란 설페이트 나트륨(DSS) 분말을 1L의 고압증기멸균수에 녹입니다. 용액이 투명해질 때까지 혼합하여 최종 작업 농도가 3%(w/v).
이 되도록 합니다.
메모: DSS 솔루션은 최대 1주일 동안 실온에서 보관하거나 사용할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 생쥐의 DSS 대장염 유도 및 평가
- 각 마우스의 초기 체중을 측정하고 기록합니다. 마우스를 표준 플라스틱 케이지에 개별적으로 넣고 케이지에 라벨을 붙입니다.
- 일반 식수를 총 7일 동안 3% DSS 용액으로 교체하여 두 그룹의 마우스 모두 자유자재로 사용할 수 있습니다.
- 마우스의 체중을 측정하고, DSS 용액 소비량을 기록하고, DSS 투여 기간 동안 매일 각 마우스의 대변을 수집 및 검사합니다. 설사 및 직장 출혈의 중증도를 관찰하고 이를 DSS 유발 질환 지수로 변환합니다.
- 실험 중에 초기 체중 대비 체중 감소율과 질병 지수를 계산하여 대장염의 증상을 평가합니다.
메모: 질병 지수는 설사와 직장 출혈에 대한 관찰을 결합하여 점수가 매겨지며 0(정상 대변, 혈액 없음), 1(부드러운 대변, 혈액 없음), 2(부드러운 대변, 혈액 적음), 3(매우 부드러운 대변, 경미한 출혈) 및 4(물변, 상당한 출혈)로 정의됩니다. 질병 지수는 각 마우스에 대해 매일 분석됩니다.
- 7일간의 DSS 치료가 끝날 때까지 경추 탈구로 마우스를 희생하고 나머지 실험을 진행합니다.
3. 조직 샘플의 준비
- 마우스를 누운 자세로 놓고 70 % 에탄올로 복부 피부를 청소합니다. 작은 가위로 복부를 3cm 길이의 정중선 절개하여 복강을 노출시킵니다.
- 집게를 사용하여 비장을 다른 조직과 조심스럽게 분리한 다음 비장을 제거하고 크기를 측정합니다.
- 집게로 결장을 확인하고 들어 올려 주변 장간막과 분리합니다. 맹장과 직장이 보일 때까지 결장 전체를 당겨 빼냅니다.
- 대장 가장자리와 골반 깊숙한 곳에서 결장을 횡절하여 결장을 분리하여 각각 근위 및 원위 결장을 해제합니다. 그런 다음 분리된 결장의 길이를 측정하고 기록합니다. 절제 과정에서 결장 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.
간침이 - 장착된 10mL 주사기로 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS) 10mL로 결장을 세척하여 용출액이 완전히 투명해질 때까지 대변과 혈액을 제거합니다.
- 조직학적 식별을 위해 조직 샘플을 근위부, 중간부, 원위부의 세 부분으로 균등하게 나눕니다. 그런 다음 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드(PFA)로 조직을 고정합니다.