생쥐의 헬리코박터 감염 통제를 위한 위내 배기(Intragastric Gavage) 기법

초록

출처: D'Costa, K. et al., 헬리코박터 감염 및 위 병리학의 마우스 모델.J. Vis. 특급(2018년)

이 비디오는 마우스 모델에서 위내 배절 기술을 통한 헬리코박터 파일로리 감염의 확립을 보여줍니다. 세균 현탁액은 입을 통해 위장으로 삽입되는 카테터를 통해 투여됩니다. 접종된 박테리아는 위에 군집하여 감염을 일으키며, 이는 숙주-병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 세균 접종의 성장 및 준비

1. -80°C에서 Helicobacter pylori(H. pylori) 또는 H. felis의 글리세롤 재고를 해동하고 다음을 포함하는 말 혈액 한천(HBA) 플레이트에서 하역배양: Blood Agar Base No.2(재료 표 참조); 변형된 "Skirrow의 항생제 선택적 보충물"(반코마이신, 10μg/mL, 폴리믹신 B, 25 ng/mL; 트리메토프림, 5 μg/mL; 암포테리신 B, 2.5 μg/mL); 및 5-10%(V/V) 말의 혈액. 박테리아는 37 ° C에서 적절한 가스 팩 (재료 표 참조)을 포함하는 2.5 또는 3.5 L 혐기성 항아리의 미세 호기성 조건에서 잘 자랍니다 <> 참고: 이러한 조건에서 자란 H. pylori 균주는 배양 1-1.5일 후에 하반배양해야 하는 반면, H. felis의 경우 일반적으로 최소 2일의 배양이 필요합니다. 적절한 배양 및 저장 매체는 이전에 상세히 설명되었다.
2. 초기에서 중기 로그 단계 배양에서 마우스 감염에 대한 박테리아 접종을 준비합니다. 한천 플레이트에서 박테리아를 부드럽게 채취하려면 각 플레이트에 1-2mL의 뇌 심장 주입(BHI) 육수를 주입합니다. Pasteur 피펫으로 플레이트의 현탁액을 흡입하십시오.
   1. 또는 BHI 육수에서 16-18시간 동안 증식된 헬리코박터 박테리아의 접종물을 준비합니다. 이 경우 2,200 x g에서 4°C에서 10분 동안 저속 원심분리로 박테리아를 수집합니다.
3. 위상차 현미경(100X 대물렌즈)에서 습식 마운트 제제를 검사하여 박테리아의 생존력과 운동성을 평가합니다. 유리 현미경 슬라이드의 10–20μL BHI 육수 방울에 박테리아 고리를 재현탁시켜 습식 마운트를 준비합니다. H. pylori보다 훨씬 큰 박테리아인 H. felis의 경우 혈구계를 사용하여 생존 가능한 박테리아의 수를 정확하게 계산합니다. Gram stain.
   를 수행하여 배양 순도를 확인합니다. 메모: H. pylori 접종은 대부분의 박테리아가 세균 또는 나선형 모양을 가진 경우에만 사용하십시오(형태는 균주에 따라 다를 수 있음).H. felis 접종은 주로 나선형 박테리아를 포함해야 합니다.대부분의 박테리아가 코코이드 형태를 가지고 있는 경우 이러한 형태는 생존 가능하지 않고 마우스에서 감염을 일으키지 않으므로 접종물을 사용하지 마십시오.
4. 위상차 현미경 아래에서 필드당 대략적인 박테리아 수(100X 대물렌즈)를 계산하고 다음 가이드를 사용하여 접종물 내 박테리아 수를 추정합니다: 필드당 1 박테리아 = 약 10⁶ Helicobacter/mL의 집락 형성 단위(CFU); 필드당 10 박테리아 = 약 10⁷ CFU/mL; 필드당 100 박테리아 = 약 10⁸ CFU/mL, 등.
   1. 혈구계를 사용하는 경우 다음 공식을 사용하여 CFU/mL를 계산합니다.
      CFU/mL = (4 x 4 필드의 평균 박테리아 수) x (희석 계수) x (10⁴).
5. 필요한 경우 BHI 육수에 희석하여 접종물의 박테리아 세포 밀도를 약 10⁷–10⁸ CFU/mL로 조정합니다.
   1. 박테리아 생존력을 극대화하려면 준비 후 가능한 한 빨리 위내 위내 위장 접종을 위해 접종을 사용하십시오.
   2. 항상 위배지 절차 직후 접종물의 생존 계수를 수행하여 H. pylori 세포 밀도와 생존력을 확인하십시오(아래 참조). H. felis는 일반적으로 배양 배지에서 고립된 군체를 형성하지 않기 때문에 이것이 항상 가능한 것은 아닙니다. 접종물 내 생존 가능한 Helicobacters의 수는 광학 밀도 측정(A₆₀₀)만으로는 측정할 수 없는데, 이는 이 방법이 생존 가능한 박테리아(즉, 세균/나선/나선) 박테리아와 생존 불가능한(즉, 코코이드) 박테리아를 구별하지 않기 때문입니다.
   3. inocula에서 생존 가능한 H. pylori 박테리아의 수를 추정하는 수단으로 광학 밀도 값을 사용하지만, 이 경우 먼저 성장 곡선을 생성해야 합니다. 이를 위해 H. pylori 배양의 A₆₀₀ 값은 시간이 지남에 따라 모니터링되고 플레이트 계수에 의해 결정된 생존 가능한 박테리아의 수와 직접 상관 관계가 있습니다.
      메모: 이러한 성장 곡선 측정을 수행하는 편리한 방법은 10% CO₂ 인큐베이터에 배치된 표준 평평한 바닥 조직 배양 플라스크를 사용하여 액체 배지(섹션 1.2)에서 박테리아를 배양하는 것입니다. 그런 다음 2-3일 동안 4-6시간마다 얻은 배양액의 분취량에서 결정된 CFU의 수를 해당 A₆₀₀ 값과 비교합니다. 중요한 것은 각 H. pylori 균주에 대해 성장 곡선이 생성되어야 한다는 것인데, 이는 이러한 균주가 서로 다른 속도로 성장할 수 있고 또한 모든 균주가 10% CO₂에서 잘 성장하는 것은 아니기 때문입니다.

2. 헬리코박터를 사용한 생쥐의 위내 배기(Intragastric Gavage

)

참고: 이 위내 위내 위장 방법은 장에 서식하는 다른 박테리아 종(예: S. Typhimurium, C. rodentium, Listeria monocytogenes)에 적용할 수 있습니다.

1. 생후 6-8주령의 특이 병원체가 없는 마우스(SPF) 및 헬리코박터가 없는 수컷 또는 암컷 마우스를 사용합니다. H. pylori 또는 H. felis에 대한 감염 실험을 위해 C57BL/6 유전적 배경을 가진 동물을 사용합니다. 본 연구에서는 핵심 선천면역수용체(knock-out 또는 KO 동물이라고 함)가 없는 야생형(WT) 및 유전자 변형 C57BL/6 마우스를 사용했습니다.
   메모: 다른 유전적 배경을 가진 마우스도 헬리코박터 감염에 사용될 수 있지만, 집락화 수준과 질병 중증도는 숙주 배경의 유형에 의해 영향을 받을 수 있습니다.
2. 일회용 1mL 주사기에 박테리아 접종물(1.5단계)을 흡인하고 제공된 바늘을 일회용 폴리에틸렌 카테터(길이, 6-8cm, 내경 0.58mm)가 부착된 23게이지 바늘로 교체합니다. 플라스틱 필름의 작은 스트립을 적용하여 카테터를 바늘에 고정합니다(재료 표 참조). 또는 멸균 플라스틱 공급 튜브(20 게이지 x 38mm)를 사용하여 바늘/카테터 어셈블리를 교체합니다.
목덜미
3. 와 꼬리의 목덜미를 꽉 잡고 쥐를 물리적으로 제지합니다.
   메모: 이 절차는 마취 없이 수행하거나 메톡시플루란 또는 이소플루란과 같은 흡입 마취제를 사용하여 수행할 수 있습니다.
4. 열린 턱의 중앙에 카테터를 삽입하고 꼬리 방향으로 식도를 향하도록 안내합니다. 카테터의 대부분 또는 전부가 더 이상 보이지 않고 위의 기저부에 해당하는 저항이 느껴질 때까지 식도를 통해(그리고 기관에서 멀어짐) 위에 쉽게 접근할 수 있도록 마우스의 목을 확장합니다. 접종당 일반적으로 100μL의 특정 부분 표본을 제공합니다(그림 1).
   메모: 마우스는 최적의 집락화 및 질병 병리학을 보장하기 위해 ≥ 10⁵ CFU로 임신해야 합니다.

결과

그림 1: 구강 위장 기법을 보여주는 이미지. 일회용 1mL 주사기와 유연한 카테터를 사용하여 위내 경로를 통해 ≥10^5CFU의 세균 접종물을 마우스에 전달합니다. 마우스는 메톡시플루란을 사용하여 마취하고 목을 단단히 잡고 식도를 통해 카테터가 위까지 접근할 수 있도록 했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세균 시약
옥소이드 블러드 한천 베이스 No.2	Thermo Fischer Scientific	CM0271B	멸균하기 전에 탈이온화된 물에 용해시키십시오.
프리미엄 제세균 말 혈액	호주 윤리적 생물학제(Australian Ethical Biologicals)	PDHB100
Bacto 브레인 하트 인퓨전 브로스	BD 생명과학	237500	멸균하기 전에 탈이온화된 물에 용해시키십시오.
CampyGen 가스 팩	Thermo Fischer Scientific	CN0035A/CN0025A
다른 시약
메톡시플루란(펜트록스)	국제 의료 개발	해당 없음
장비 및 플라스틱 제품
Oxoid 혐기성 단지	Thermo Fischer Scientific	HP0011/HP0031
COPAN 파스퇴르 피펫	Interpath 서비스	200CS01
Eppendorf 5810R 원심분리기			2,200rpm에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아 펠릿 수집
23g 정밀 글라이드 바늘	BD 생명과학	301805
파라필름 M	베미스, VWR	PM996
Portex 파인 보어 폴리에틸렌 튜빙	스미스 메디컬	200분의 800/100
플라스틱 공급 카테터	인스텍 연구소	FTP20-30
1ml 투베르쿨린 루어 슬립 일회용 주사기	BD 생명과학	302100
Eppendorf micropestle 1.2 - 2 mL tube용	시그마 알드리치	Z317314	위 균질화에 사용되는 오토클레이브 폴리프로필렌 유봉
멸균 플라스틱 루프	랩서브	LBSLP7202

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