방법 논문

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes

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DOI:

10.3791/3076

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2011년 8월 9일

 ,  ,  , 
1St Vincent’s Institute, Department of Medicine, The University of Melbourne, 2Department of Microbiology and Immunology, The University of Melbourne

이 논문에서

요약

리스테리아 monocytogenes는 생쥐에서 세균을 세포에 면역 반응과 유전 자화율을 연구를위한 모델 생물이다. 이 방법은 박테리아 부하를 측정하고 리스테리아 감염으로 인한 면역 세포의 변화를 결정하는 외과 분석을위한 생쥐의 간 및 비장의 단일 셀 suspensions를 생성하는 하나 있습니다.

초록

리스테리아 monocytogenes는 (리스테리아) 그람 양성 통성 세포내 병원체 1입니다. 마우스 연구는 일반적으로 리스테리아의 정맥 주사를 채용, 어떤은 조직의 감염이 초래합니다. 주입 후, 리스테리아 신속하게 CD8α + 돌기 세포와 Kupffer 세포 3,4에 의해 이해로 인해 비장과 간장에 disseminates. 일단 phagocytosed, 각종 세균의 단백질은 phagosome 탈출 cytosol 내에 생존하고, 인접 세포에게 5 리스테리아 감염 수 있습니다. 감염의 처음 세 일 동안, 다른 타고난 면역 세포 (예 : monocytes, neutrophils, NK 세포, 세포 돌기) 리스테리아 확산을 최소화 bactericidal 메커니즘을 중재. CD8 + T 세포는 이후 모집 일반적으로 감염 6 10 일 이내에 호스트에서 리스테리아의 최종 통관에 대한 책임이 있습니다.

감염된 생쥐에서 리스테리아의 성공적인 허가는 호스트 면역 반응 6 해당 증상에 따라 달라집니다. 근친 마우스 종자 7,8 사이에 민감한 다양한있다. 일반적으로, 리스테리아 감염 증가 느끼기 쉬운 상태로 마우스는 마우스에 비해 저항력이 증가 세균 하중 및 / 또는 지연 허가를 보여주는, 박테리아 증식을 제어하는 덜 수 있습니다. 결합 분석 및 녹아웃 마우스 종자를 포함한 유전자 연구, 시퀀스 유사 리스테리아 감염 6,8-14에 호스트 응답에 영향을 미치는있는 다양한 유전자를 발견했습니다. 결단력과 다른 마우스 변종 사이의 감염 속도론의 비교 그러므로 리스테리아에 대한 면역 반응에 기여하는 호스트 유전 요소를 식별하는 중요한 방법입니다. 다른 리스테리아 변종에 호스트 응답의 비교도 항생제 치료 또는 예방 접종 디자인에 대한 잠재적인 대상으로 될 수있다 세균성 독성 요소를 식별하는 효과적인 방법입니다.

우리는 여기에 세균 하중 (콜로니 형성 단위 [CFU] 당 조직)을 측정하고 리스테리아에 감염된 생쥐에서 면역 반응의 외과의 분석을위한 간 및 비장의 단일 셀 suspensions을 준비를위한 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 초기 소설 마우스 종자에 리스테리아 감염의 특성뿐만 아니라, 리스테리아에 감염된 다른 마우스 종자 간의 면역 반응 비교에 특히 유용합니다. 우리는 혈액 한천에 교양하면 β - 용혈 1 (그림 1)로 인해 각각의 콜로니 주위 특성 헤일로 영역을 전시되는 변형율 15 EGD 리스테리아 monocytogenes를 사용합니다. 박테리아로드하고 면역 반응은 아래에 설명된 프로토콜을 사용하여 외과 분석을위한 혈액 한천 플레이트 및 준비 조직 세포 suspensions에 culturing 조직 homogenate에 의해 감염 후 언제든지 포인트에서 확인할 수 있습니다. 우리는 immunocompromised 또는 임신 개인 리스테리아 처리하지 말아야합니다 것이며, 작업 개시 전에 관련 기관 biosafety위원회 동물 시설 관리 자문해야합니다.

프로토콜

1. 리스테리아 monocytogenes의 Culturing 및 장기 저장 (리스테리아)

  1. 미리 만들어진 말 혈액 한천 배지 (HBA) 접시를 만들거나 구입할 수 있습니다. 드라이 플레이트 이전 37 이전 잠복기로 사용하는 ° C 야간 또는 1 시간 동안 층류 캐비닛에서 밝혀 두지.
  2. 감염된 마우스 조직 homogenate, 동결 건조된 주식, 냉동 글리세롤 주식 또는 최근 리스테리아 문화 (하위 교양 10 개 이상의 세대에 한 주 이전보다가 아닌 즉,)에서 식민지 다음 중 하나에서 가능한 리스테리아를 얻습니다 . 모든 리스테리아는 살균 inoculating 루프를 사용하고이 프로토콜에서 설명하는 모든 방법에 대한 무균 기술을 채용 취득해야합니다.
  3. 기본 inoculum 확산으로 판 표면의 ¼ 이상 리스테리아 행진 : 같은 살균 inoculating 루프를 사용하여 그림 1에 표시된 HBA의 접시에 리스테리아 승리. 주요 전염에서 단방향 줄무늬 일련의 확인하십시오. 줄무늬의 각 설정하기 전에 신선하거나 다시 소독 루프를 사용하여 2-3 시간을 줄이 반복합니다. ° C 야간 37 번호판을 품어.
  4. 1 개월 최대 기간 4 ° C에서 리스테리아 HBA 플레이트를 저장하거나 장기 저장을위한 리스테리아 문화를 준비하는 1.5 단계로 이동합니다.
  5. 멸균 inoculating 루프를 사용하여 HBA의 접시에 신선한 리스테리아 문화에서 하나의 식민지를 선택하고 30 ML 맥카트니 병의 뇌 심장 주입 (BHI) 국물 (제조 업체의 지시에 따라 준비) 10 ML의 예방.
  6. 37 ° C 하룻밤에 180rpm에서 궤도 통에 리스테리아 문화를 품다.
  7. 40 % 최종 글리세롤 농도 (V / V)을 구하는 1시 1분 비율 액체 리스테리아 문화 살균 80 % 글리세롤을 (V / V) 추가합니다. cryovials에 0.5-1 ML aliquots를 전송하고 -70에서 리스테리아 / 글리세롤 주식을 저장 ° C.

팁 & 참고 사항 :

  • 리스테리아의 성장은 이러한 혈액 한천의 범위 (말, 양, 기니피그 또는 인간의 피가 보충), 뇌 심장 주입 (BHI) 한천이나 국물, 또는 효모와 tryptic 간장 국물과 같은 다른 비 선택적 미디어에 지원할 수 (TSB - YE) 압축을 풉니다. 오염 성장 정의 항생제 저항 (예 : L. monocytogenes의가 10403S)과 리스테리아 종자에 대한 미디어에 항생제를 추가하거나 선택 리스테리아의 성장을 지원하는 옥스포드 미디어를 사용에 의해 문화의 최소화하실 수 있습니다.
  • 리스테리아가 안된 소스로부터 얻은 경우에는, 그것은 추가적인 검사의 신원을 확인하기 위해 수행하는 것이 좋습니다 리스테리아 (L.의 monocytogenes는 그람 양성이며, 이외의 포자 형성, 운동성이있는 <30 ° C, facultatively 무산소 카탈 라 아제 긍정하고, 데이스 제외). 얻은 문화는 순수 문화 얻은 것입니다 수 있도록 리스테리아 선택적 매체 성장하실 수 있습니다.
  • HBA 번호판을 건조하면 접시에 박테리아 식민지의 최적의 분리가있다는 것을 보장합니다.
  • 리스테리아의 냉동 글리세롤의 주식을 만들 때, 가능한 적은 세대 (<5 최고)의 미만 일주 과거와 현재 하위 양식 아르 신선한 HBA 리스테리아 문화를 사용합니다.
  • 리스테리아 냉동 글리세롤 주식에서 얻은 때문에 냉동 글리세롤 주식의 신선한 리스테리아 문화를 파생하는 경우, 첫번째 통로 직접 액체 매체 subcultured 때 저조한 성장 고체 매체 (즉, HBA 판)에하여야한다.

2. 생체내 감염 연구를위한 준비 및 리스테리아 감염 주식 저장

  1. HBA 접시에 냉동 글리세롤 주식 (1.7 단계)에서 리스테리아 리크로 단계 1.3 설명했다. 37 접시를 품어 ° C 다음날에 사용하기 위해 하룻밤 사이에.
  2. 리크 문화에서 하나의 리스테리아 식민지를 선택하고 10 ML BHI 국물의 예방. 국물에 한천를 전송하지 마십시오.
  3. 180 RPM 37의 궤도 통에 리스테리아 BHI 문화를 품어 ° C 중순 대수 위상 (OD600 = ~ 0.4)에 적용됩니다. 이것은 일반적으로 3~4시간 걸립니다.
  4. 무균 0.9 ML의 나누어지는을 가지고 흔들림의 3~4시간에서 600 nm의에서 OD 읽기를 구하십시오. OD 독서 <0.3이라면, 180 RPM 37의 궤도 통에 문화를 계속 ° C는 OD 읽는까지 ~ 0.4이다.
  5. 1 ML 무균 80 % 글리세롤 (V / V) 10 ML 리스테리아 BHI 국물 문화로 (OD600 ~ 0.4) 추가합니다. 부드럽게 믹스 및 0.5-1 ML의 aliquots의 1.5 ML의 microfuge 튜브로 전송할 수 있습니다.
  6. -70에서 10 분 및 저장소 얼음 aliquots를 놓고 ° C. 10 9 CFU / ML의 순서에 따라 일반적으로 전염성이 재고 리스테리아의 농도를 결정하기 위해 녹았 한 나누어지는를 남겨주세요.
  7. unfro의 1시 10분 시리얼 dilutions을 수행10 -8 희석하기 위해 PBS에 선 (禅) 리스테리아 감염 주식. 유리 확장기를 사용하여 복제에서 미리 건조 HBA 플레이트 (단계 1.1)에 100 μL undiluted의 각 후속 희석을 전파. ° C 야간 37 번호판을 품어.
  8. 각 접시에 콜로니의 수를 세어 다음과 같은 계산을 사용하여 냉동 전염성 재고 문화의 리스테리아 농도 결정 : 농도 (CFU / ML) 식민지의 개수 = X 희석 팩터 / 0.1 ML 있습니다. 계수에 대한 선택 번호판적으로 가능한 박테리아의 CFU 농도의 신뢰성 평가를 위해 30-300 식민지 있어야합니다.
  9. -70에서 리스테리아 감염 주식을 저장 후 며칠 ° C, 한 튜브 좀 녹여. 같은 단계를 2.7과 2.8에 설명된 가능한 리스테리아의 농도를 결정합니다. 이 농도는 2.8 단계에서 신선한 전염성 주식 결정되는 것과 유사합니다.

팁 & 참고 사항 :

  • 리스테리아 감염 주식은 일반적으로 장기 보관 (40 %)에 대한 냉동 리스테리아에 비해 낮은 비율 글리세롤 (8 %)에서 동결입니다.
  • 냉동 리스테리아 감염 주식 최대 3 개월까지 -70 ° C에서 일반적으로 안정됩니다. 삼개월 이상 사용하는 경우, 그것은 새로운 전염성 재고가 HBA의 접시에 신선한 리스테리아 문화 준비하는 것이 좋습니다.
  • 해동 리스테리아 감염 주식의 농도 (2.9 단계)이 단계로 2.7과 2.8에 설명되어있는 신선한 주식과 다를 경우 (CFU에서 즉,> 20 % 감소), 그리고 새로운 냉동 전염성이 주식이 준비되어야합니다.
  • 한 실험에 대한 새로운 박테리아 inoculum을 준비하는 것보다 소비 초기에 더 많은 시간, 냉동 리스테리아 감염 주식을 준비하기 전에 감염과 생쥐가 동일한 냉동 주식에서 감염된 실험 사이 좋은 일관성 CFU 농도의 정확한 결정을 가능하게하지만.

3. 리스테리아 inoculum와 생쥐의 정맥 주사의 준비

  1. 마우스를 따라 주입되는 리스테리아의 농도를 결정합니다. 정맥 주사의 경우, 마우스 당 200 μL inoculum의 CFU가 사용됩니다.
  2. 리스테리아 감염 주식 냉동 나누어지는을 (단계 2.6에서) 좀 녹여. 원하는 리스테리아 CFU의 농도로 PBS에 전염성이 주식을 희석. 의 주입과 결정에 대한 inoculum 충분히있다는 것을 보장하기 위해 모든 쥐 주입에 필요한 볼륨을 더블 리스테리아 CFU 사전 및 사후 사출 (단계 3.3 및 3.7).
  3. 준비 리스테리아 inoculum에서 0.1 ML의 aliquots을 배 제거하고, 생쥐의 주입하기 전에 각 나누어지는 위해 PBS에 1시 10분 희석을 준비합니다. 플레이트 0.1 HBA 플레이트에 각 희석의 ML, 37에서 야간 번호판을 품어 ° C. 식민지의 개수를 카운트하고 리스테리아 inoculum의 사전 주입 농도 결정 : 농도 (CFU / ML) = (식민지의 수 X 희석 계수) / ML 것을 희석 요소에 대한 도금합니다.
  4. 깨끗한 케이지에 주입되도록 마우스를 전송합니다. 5 분 (마우 스나 증가 40 ° C도 사용할 수 위의 새장 온도를 레코딩하지 않습니다 다른 적당한 온도 장치)에 대한 ~ 50cm 250w 적외선 램프 아래에있는 새장을 배치하여 마우스를 따뜻하게. 꼬리 정맥 주사에​​ 대한 접근 금지 장치에서 마우스를 놓습니다.
  5. 부드럽게 일관된 현탁액에게 주사기가 로드될 때마다을 유지하기 위해 리스테리아 정지를 섞는다.
  6. 마우스의 측면 꼬리 정맥을 찾아, 부드럽게 70 % 에탄올 닦아와 27 게이지 바늘로 주사기를 사용하여 리스테리아 inoculum 200 μL를 (원하는 농도에서) 주사로 닦으십시오. 간단히 멸균 거즈로 사입 구에 압력을 적용합니다. 그 케이지 마우스를 반환합니다.
  7. 모든 생쥐의 주입이 완료되면, 리스테리아 inoculum의 사후 분사 농도를 결정 inoculum의 나머지 금액을 사용하여 3.3 단계를 반복합니다.
  8. 생쥐에 주입 리스테리아의 크기는 사전 및 사후 사출 리스테리아 inoculum 샘플에서 결정 평균 CFU로보고됩니다.

팁 & 참고 사항 :

  • 우리는 일반적으로 500 주입 - 3,000 CFU (2500 200 μL를 CFU / ML - 15,000 CFU / ML inoculum) 방지 마우스 변형 (예 : C57BL / 6) 및 민감한 마우스 변형 (예 : BALB / C 사이의 세균 하중과 면역 반응을 비교 ).
  • 전염성 주식이 최소한 10 5 PBS에 희석되는 경우, 다음 세척 단계는 일반적으로 잔류 미디어 / 글리세린을 제거하는 필요하지 않습니다. 전염성 주식이 최소한 10 5 PBS에 희석되지 않습니다면, 세척 단계는 다음과 같이 잔류 미디어 / 글리세린을 제거하는 단계 3.2에 추가합니다 :4 10 분 2,100 XG에서 원심 분리에 의해 수집된 해동 전염성 주식 및 박테리아에 DD 구 ML PBS ° C. 뜨는 제거 10 ML 멸균 PBS, 반복 원심 분리에 pelleted 박테리아 세포를 resuspend하고, 원하는 볼륨에있는 세균 세포 펠렛을 resuspend. 로 단계 3.3 및 3.7에서 설명한 사전 및 사후 사출 리스테리아 inoculum 샘플에서 평균 CFU를 결정합니다. 이것이 세척 단계는 박테리아의 일부 손실을 초래할 수 있다고 지적하고, 그것은 이러한 손실을 사전에 결정하는 것이 좋습니다 필요한 농도의 inoculum 제작에 차지하는 것입니다.
  • 안전 리스테리아와 마우스를 주사 후 주사기와 바늘을 폐기.

4. 분석을 위해 리스테리아에 감염된 생쥐에서 간 및 비장 제거

  1. 같은 CO 2 질식으로 지역 동물 윤리위원회에 의해 승인된 방법을 사용하여 원하는 시점 포스트 감염에 감염된 마우스를 Euthanase.
  2. 즉시 1 ML의 주사기 25 게이지 바늘을 사용하여 안락사 후 심장 출혈​​을 수행합니다. 가능한 많은 피를를 수집합니다. 담즙 방광을 제거하고 하부 대정 맥을 끊다.
  3. 머리 방향과 횡경막의 위치 간장에 앉아 있도록 왼쪽으로 간 엽 (叶)을 뒤집어, 신중하게 오른쪽으로 장내를 추진하여 간장 포털 정맥을 노출. 간장 포털 정맥 하단 오른쪽에서 간 하단에 피드.
  4. 26 게이지 바늘을 사용하여 간장 포털 정맥에 10 ML PBS를 주입하여 간 Perfuse. 포털 정맥을 통해 주입 PBS는 절단 하부 대정 맥에서 종료됩니다. 간 재관류는 수확한 세포 간 아니라 순환 혈액에서되는지 확인합니다.
  5. 마우스의 뱃속, 외과 버퍼에서 개최하고, 얼음에 저장에서 perfused 간장을 제거합니다. 외과 분석을위한 간의 준비를 위해 5.1 단계로 이동합니다.
  6. 마우스, 외과 버퍼에서 개최하고, 얼음에 저장에서 비장을 제거합니다.
  7. 반으로 전체 비장을, 무게, 그리고 절반 중 하나를 달다. 놓으 외과 버퍼의 절반과 6.1 단계로 이동합니다. 얼음 Stomacher 가방에있는 다른 반쪽을 장소와 7.1 단계로 이동합니다.

팁 & 참고 사항 :

  • 단계 4.5 및 4.6에서 공기에 대한 조직의 어떤 부분의 노출을 최소화하기 위해 완전히 잠수함 조직을 충분한 외과 버퍼를 사용합니다.
  • ~ 30 도로로 굽습니다 ½ 인치 길이의 26 게이지 바늘이 더 간장 포털 정맥에 PBS의 주입을 용이하게하실 수 있습니다.
  • 제대로 perfused 때, 간장 1-2 ML PBS를 주입 후 브라운 빛을 어두운 붉은 색에서 변합니다.
  • 간이 외과의 분석을 위해 필요하지 않은 경우, 재관류 필요가 없습니다. 간은 고립과 Stomacher 가방에 직접 수집하여 7 단계에서 설명한대로 처리할 수 있습니다.
  • 그것은 비장과 간장에 세균 CFU와 면역 세포 생존 능력에 미치는 영향을 최소화 있기 때문에 마우스의 안락사에 대한, CO 2 질식이 선호하는 방법입니다. 혈액 수집이 필요하지 않은 경우, 자궁 경부 전위가 다른 안락사 방법으로 사용할 수 있습니다. 이것은 장기 중량 또는 면역 세포 생존에 영향을 미칠 수있는 안락사 방법 (예 : thiobarbiturates) 사용하지 않는 것이 좋습니다.

5. 외과 분석을위한 간장 세포 현탁액의 준비

  1. 60mm 페트리 접시 안에 70 μm의 셀 스트레이너에 외과 버퍼 (4.5 단계)와 간장을 배치하여 단일 셀 suspensions를 생성합니다. 단일 세포 현탁액을 형성 때까지 5 ML 주사기의 플런저를 사용하여 셀 스트레이너를 통해 조직을 누르십시오.
  2. 50 ML 원뿔 나사 캡 튜브에 페트리 접시에서 간장 단일 세포 현탁액을 전송하고 차가운 외과 버퍼 40 ML에 전체 볼륨을 가지고.
  3. 소용돌이 세포 현탁액과 간 박테리아 하중을 결정하는 1 ML의 나누어지는 가져가라. 7.3 단계 및 Stomacher 가방에 조직 homogenate 대신이 한 ML의 나누어지는를 사용하여 이동합니다.
  4. 4 5 분 500 XG ° C에서 원심 분리하여 세포 펠렛 40 ML 차가운 외과 버퍼에 뜨는, resuspend 펠렛을 폐기, 펠렛 4 5 분 500 XG에서 원심 분리하여 세포 ° C, 그리고 뜨는 폐기.
  5. 상온 20 ML isotonic Percoll의 세포 펠렛을 Resuspend. 실온에서 12 분 700 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 위에 떠있는 세포의 표면에 뜨는 및 디스크처럼 시트 (예 : hepatocytes)를 폐기하십시오. 최대 자주 역전 10 분까지 실온에서 적혈구와 부화 세포를 lyse 4 ML TAC 버퍼에있는 백혈구 함유 펠렛을 Resuspend.
  6. 새로운 10 ML의 원심 관에 100 μm의 나일론 막 필터를 통해 세포 현탁액.
  7. 밑받침 1 ML FCS / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼와 세포 현탁액을 필터링. 350 XG에 원심 분리기4 5 분 ° C가 뜨는 폐기, 5 ML 외과 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼에 resuspend.
  8. 4 5 분 350 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기 ° C가 뜨는 버리고, 그리고 펠렛의 크기에 따라 0.5-3 ML 외과 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼에 resuspend 세포 펠릿.
  9. 5.8 단계에서 정지 볼륨에 따라 trypan 파란색으로 세포 현탁액의 1시 5분에서 1시 20분까지을 희석. hemacytometer를 사용하여 가능한 간장 leukocytes (그림 4A)을 계산하고 다음과 같이 총 가능한 세포를 확인 : 가능한 세포 / 기관 = 계수 영역의 X 희석 팩터에서 세포의 수를 X 10 4 X 볼륨 (ML). 간 단일 셀 suspensions 그런 다음 원하는 세포 - 표면 마커에 대한 특정 항체로 분류하고 외과의 분석하실 수 있습니다.

팁 & 참고 사항 :

  • 별도로 명시하지 않는 한 얼음에 세포 보관하십시오.

6. 외과 분석 지라 단일 셀 정지 준비

  1. 60mm 페트리 접시 안에 70 μm의 셀 스트레이너의 외과 버퍼와 비장 중 절반 (단계 4.7) 배치하여 단일 셀 suspensions를 생성합니다. 부드럽게 단일 세포 현탁액을 형성 때까지 5 ML 주사기의 플런저를 사용하여 셀 스트레이너를 통해 조직을 누르십시오.
  2. 10 ML의 원심 관에 페트리 접시에서 비장 단일 세포 현탁액을 전송하고 차가운 외과 버퍼를 사용하여 10 ML에 전체 볼륨을 가지고.
  3. 4 5 분 350 XG ° C에서 원심 분리하여 펠렛 세포가 자주 역전 10 분 위해 상온에서 적혈구, 그리고 품어 세포를 lyse 4 ML TAC 버퍼에 뜨는, resuspend 세포 펠렛을 삭제.
  4. 새로운 10 ML의 원심 관에 100 μm의 나일론 막 필터를 통해 세포 현탁액.
  5. 밑받침 1 ML FCS / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼와 세포 현탁액을 필터링. 4 5 분 ° C 350 XG에 원심 분리기는 뜨는 폐기하고, resuspend 세포 펠릿 5 ML 외과 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 인치
  6. 4 5 분 350 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기 ° C가 뜨는 버리고, 그리고 펠렛의 크기에 따라 3-8 ML 외과 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼에 resuspend 세포 펠릿.
  7. 세포 현탁액의 1시 10분을 희석 - trypan 파랑 (증류수에 0.4 %)에 1시 20분 단계 7.6에서 정지 볼륨에 따라 다릅니다. hemacytometer를 사용하여 가능한 splenocytes 카운트 - 다음 원하는 세포 - 표면 마커에 대한 특정 항체로 분류하고 외과에 의해 분석할 수 오르간 비장 단일 셀 suspensions 당 총 가능한 세포를 계산하는 단계 5.9를 참조하십시오.

팁 & 참고 사항 :

  1. 별도로 명시하지 않는 한 얼음에 세포 보관하십시오.

7. 리스테리아에 감염된 생쥐에서 조직에 세균 하중 측정

  1. 비장의 절반을 포함하는 Stomacher 가방의 상단을 접으십시오. Stomacher 가방을 쥐고하는 누출을 방지하기 위해 종료하지만, 클린 벤치 또는 층류 캐비닛에이 평평하다. 조직이 가방 안에 으깬 때까지 조직을 통해 두꺼운 둥근 펜을 롤.
  2. 으깬 조직을 포함하는 각 Stomacher 가방에 PBS의 5 ML을 추가합니다. Stomacher에 Stomacher 가방을 놓고, 10 분 고속에서 Stomacher를 실행합니다.
  3. 피펫으로 Stomacher 가방 (또는 간장 세포 현탁액의 한 ML의 나누어지는)에 homogenate를 섞습니다. 중복에서 다음을 수행합니다. 96 - 웰 플랫 바텀 플레이트 300 μL를 전송합니다. 96 - 웰 플레이트의 우물 내의 각 조직 homogenate 샘플 10 -5 희석에 1시 10분 시리얼 dilutions을 (270 μL PBS로 30 μL) 수행합니다.
  4. 조심스럽게 유리 확장기를 사용하여 미리 건조 HBA 플레이트에 각 희석의 0.1 ML를 확산. ° C 야간 37 번호판을 품어.
  5. 각각의 희석에 대한 CFU의 개수를 카운트하고 계정으로 조직의 부분 (예 : 반 비장), 희석 요인, 그리고 조직 homogenate의 총 볼륨 (5 ML 40 ML) 복용 조직 당 CFU를 계산 : CFU / 조직 = CFU/0.1는 ML은 X 희석 계수 X ML / 조직, 비장에 대한 조직의 균질에 사용되는 비장 샘플의 비율 무게 (단계 4.7 참조​​)이 번호를 나눕니다.

도움말 및 메모 :

  • 제조 업체에서 지정한 하나 이상의 Stomacher 가방은 최대 볼륨을 초과하지 않는 총 볼륨만큼 한 번에 Stomacher 배치 수
  • Stomacher를 사용할 수없는 경우에는 조직의 균질 화기 대신 사용할 수 있습니다. 또는, 다음과 같은 방법이지만, 같은 효율 않고, 수동으로 단계 7.1 및 7.2 대신에 장기 더운 물에 담가서 부드럽게하는 데 사용할 수 있습니다 : 봉인 소독 비닐 봉투에 적절한 기관과 누출을 방지하기 위해 종료 가방을 누른 상태 클린 벤치에 누워 . 조직이 완전히 으깬 때까지 가방을 통해 반복적으로 500 ML의 실험실 유리병을 롤. 각 가방에 PBS의 5 ML을 추가하고 7.3 단계로 진행합니다.
  • 그것은 HBA 플레이트가 완전히 건조되는 단계 7.4에서 매우 중요합니다(한천에는 수분 즉 없음). 그렇지 않으면 그것은 제대로 계산 수있는 별개의 리스테리아 식민지를 얻을 어려울 수 있습니다.
  • 제한 HBA 플레이트가있다면 대체 단계 7.4은 다음과 같습니다 : 5-6 섹션, 각 희석 하나에 그것을 나눌 사전 말린 HBA 플레이트 (단계 1.1)의 하단에 라인을 그립니다. 조심스럽게 피펫 각 조직의 homogenate에 대한 HBA 판에 해당하는 부분으로 각 희석의 25 μL가 - 확장기로 확산하지 않습니다. 조직 homogenate의 방울이 반전 번호판 전에 건조 때까지 기다리십시오. ° C 야간 37 접시를 품어. 최대 80 식민지에는 한천 플레이트 한 방울로 인해 구분할 수 있습니다.
  • 조직 homogenates의 희석은 동물에서 리스테리아 성장에 따라 수 있으며 안락사의 시간에 동물에 의해 표시되는 증상에 따라 예상하실 수 있습니다. 눈에 띄게 죽어가는 아르 생쥐의 경우 다음 추가 dilutions 더 정확하게 박테리아 부하를 결정하기 위해 필요할 수 있습니다. 리스테리아이나 감염 기간의 끝에 euthanased 생쥐의 낮은 복용과 주사 생쥐의 경우, undiluted 조직 homogenate는 세균 하중을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
  • 번호판이 37 incubated 수 있습니다 ° C 2-3 일동안은 하루 또는 상온에서.

8. 대표 결과 :

표준 감염 실험, 리스테리아는 냉동 글리세롤 주식로부터 얻은 것입니다 그리고 그림 1과 같이 HBA의 접시에 줄무늬. 몇 식민지가 줄이 이후에 취득하는 경우,이 가난한 줄이 또는 최적의 냉동 주식보다 덜를 나타낼 수 있습니다. 리스테리아 감염 주식은 갓 줄무늬 HBA 판에서 준비하고 -70 ° C.에 저장된 세균 통관 및 면역 반응을 측정, 우리는 정기적으로 2,500 CFU / ML에 해동 리스테리아 감염 주식을 희석 - 15,000 CFU / ML 500으로 그들을 감염 200 μL와 쥐 주입 - 3,000 CFU. 우리는이 프로토콜을 사용 리스테리아의 하위 치사량 복용에 감염된 쥐가 transiently 처음 몇 일 이내에 쓸 모피, hunched 자세와 체중 감소를 전시 수 있습니다 관찰합니다. 이러한 증상은 그룹의 나머지 (예 : "분명한"국외자)에 다르게 반응 여부, 개별 마우스가 감염에 의해 영향을 얼마나 심각하게하기 위해 같은 시각적 큐를 제공하고, 과도한 고통과 임박한 죽음을 막을 방법이 안락사가 필요한지 여부 감염으로 인해.

그림 2-5으로 표시 결과에, 마우스는 리스테리아 감염 재고 갓 해동 나누어지는를 사용하여 감염되었습니다. 다른 시간 지점에 후 감염, 생쥐는 euthanased되었으며 간장과 비장이 제거되었습니다. 그림 2는 단일 마우스 희석 비장의 homogenate가 교양있는 HBA 접시를 보여줍니다. 희석 요인이 높은되면서, 별개의 CFU를 계산하는 것은 적어도 두 dilutions 가능합니다 그러한 식민지의 개수에 명확 감소가 있어야합니다. 마우스가 리스테리아 감염 (예 : 검출 한계 = 100 CFU / 조직)를 해제있다면, 다음 <5 리스테리아 식민지가 undiluted 조직 homogenate 200 μL로 확산했다는 HBA 판에 존재합니다. 간 및 / 또는 비장은 고립 동안 창자 또는 다른 외부 세균으로 오염되는 경우, HBA 판의 식민지는 다른 형태로 (즉, 특성 후광과 리스테리아 식민지의 창백한 색깔을하지 않습니다) 및 / 또는 수를 전시 할 것 같다 에 대한 기대됩니다 무엇 식민지 카운트에서 다른 리스테리아 (즉 너무 적거나 너무 많은). 그림 3은 C57BL / 6 마우스에 대한 일반적인 리스테리아 통관 곡선을 보여줍니다 - 리스테리아는 일반적으로 간을보다 비장에서 더 빨리 지워집니다 그리고 통관 5 일 감염 전까지는 발생하지 않습니다.

그림 4는 감염 후 다른 시간 지점에 감염된 생쥐의 비장과 간장에서 준비 단일 셀 suspensions에 따라 셀 카운트를 보여줍니다. 이 방법은 비장에서 간장과> 80 %에서 준비 단일 셀 suspensions에서> 95% 백혈구 순도를 얻을 수 있습니다. 백혈구 순도는 냄비 - 백혈구 마커 CD45 (복제 30 F11)에 대한 특정 단클론 항체를 사용하여 외과의 분석에 의해 결정하실 수 있습니다. 일반적으로, splenocytes 및 간장 leukocytes의 숫자는 비장의 splenocytes의 증가에 비해, 그것이 간장 leukocytes에서 큰 배 증가 전시 간으로 감염을 취소하는 데 걸리는 기간 동안 증가하지만, 상당히 작은 총. 면역 세포의 종류와 숫자는 셀 표면 마커 특정 항체와 단일 셀 suspensions를 라벨에 의해 결정하실 수 있습니다. 라벨 세포는 다음 외과의 분석에 의해 감지하실 수 있습니다. 그림 5는 CD8 + T 세포에 대한 대표적인 결과를 제공합니다. C57BL / 6 마우스에 표준 리스테리아 감염 동안 CD8의 숫자 + T 세포는 transiently 일 2-3 befor에서 비장의 lymphopenia에 의한 감소E는 비장과 간장 모두에서 5 일 이후의 감염에서 눈에 띄게 증가합니다.

그림 1
그림 1. HBA 플레이트는 리스테리아와 줄무늬. 무균 inoculating 루프는 냉동 글리세롤 주식에서 리스테리아 승리하는 데 사용되었다. 접시는 ° C 야간 37 incubated했다. 개별 식민지를 둘러싼 특성 후광은 β - 용혈에 의한 것입니다.

그림 2
그림 2. 조직은 HBA 플레이트에 교양 리스테리아에 감염된 마우스에서 homogenate. 간장은 삼일 후 감염에 리스테리아에 감염된 C57BL / 6 마우스에서 수확했다. 조직 homogenate는 각 1시 10분 희석 준비와 dilutions 10 -4 희석 (A)와 10 -5 희석 (B)에 대한 확산 100 μl 전체 판뿐만 아니라 HBA 접시 25 μl 방울로 배치되었습니다 10 undiluted -5 (C). 접시는 ° C 야간 37 incubated했다. 개별 식민지의 계산 활성화 dilutions 해당 시점 이후의 감염에 세균성 부하 (예 : CFU / 조직)를 결정하는 데 사용됩니다.

그림 3
그림 3. 감염된 C57BL / 6 3 마우스 및 칠일 후 감염의 비장과 간장에 리스테리아로드합니다. C57BL / 6 생쥐는 리스테리아의 ~ 2,000 CFU에 감염되었습니다. 각각의 시점에서, 생쥐는 간장이 perfused 및 비장과 수확 되었음 euthanased되었고, 지라 homogenate (A) 또는 간장 단일 세포 현탁액 (B)의 dilutions는 세균 하중을 결정하기 위해 HBA 플레이트에 교양되었습니다. 솔리드 라인 기하 평균을 표시하고, 수직 막대 SEM을 나타냅니다. 점선은 세균 하중의 정확한 측정에 대한 검색 제한이 실험 100 CFU / 기관을 나타냅니다.

그림 4
그림 4. 감염된 생쥐에서 조직을위한 생균 계산됩니다. C57BL / 6 생쥐는 리스테리아의 ~ 2,000 CFU에 감염되었습니다. 각각의 시점에서, 생쥐는 euthanased 간은 perfused 및 비장과 수확했다. 세포는 trypan과 청색의 스테인드 및 단계 5.9 (A)에서 설명한대로 hemacytometer를 사용하여 계산되었다. Splenocyte (B)와 간장 백혈구 (C)는 리스테리아에 감염된 생쥐에서 준비 단일 셀 suspensions 얻은 계산됩니다. 라인의 기하학적 의미를 나타냅니다.

그림 5
그림 5. CD8의 외과 분석 + T 세포 리스테리아에 감염된 생쥐 인치 C57BL / 6 생쥐는 리스테리아의 ~ 2,000 CFU에 감염되었습니다. 각각의 시점에서, 생쥐는 euthanased 간은 perfused 및 비장과 수확했다. 단일 셀 suspensions는 T 세포 (인 경우에는 3 번 CD, TCRβ, CD4, CD8) 특정 항체 물들일되었습니다. (A) % CD8과 함께 대표적인 외과 프로파일 + T 세포가 + / - SEM. 비장의 (B) 총 CD8 + T 세포. 간장 (C) 총 CD8 + T 세포.

토론

Listeria는 세포 내 세균에 대한 호스트 면역 반응을 특성화하는 데 가장 널리 사용되는 미생물 중 하나입니다6. 본 프로토콜을 통해 특정 마우스의 동일한 조직 내에서 세균 부하와 면역 세포 반응을 동시에 측정할 수 있습니다. 감염된 각 마우스의 특정 조직에 대해 이러한 이중 측정을 수행하면, 마우스 코호트 내(서로 다른 마우스 계통 또는 감염 후 시점) 및 코호트 간의 비교를 더욱 견고하게 할 수 있습니다. 경구 투여를 통한 Listeria 감염 또한 마우스의 면역 반응 연구에 사용될 수 있으나, 정맥 주사 감염이 자주 사용되는 이유는 다음과 같습니다. 1) 혈류로의 신속하고 효과적인 전달이 보장되며, 2) 동기화되고 일관된 전신 감염을 유도하고, 3) Mus 종은 E-cadherin 수용체를 인코딩하는 유전자에 돌연변이가 있어 경구 투여를 통한 Listeria 감염이 제한되기 때문입니다(이 돌연변이는 Listeria가 마우스 E-cadherin 수용체에 결합하고 위장관의 상피층을 효율적으로 통과하는 능력에 영향을 미칩니다)16-18.

본 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 생존력과 병원성을 보장하기 위해 Listeria 접종원 스톡은 신선한 overnight HBA 배양액으로부터 생성해야 합니다. 둘째, 첫 번째로 접종한 마우스와 마지막으로 접종한 마우스 간의 CFU 농도 차이가 크게 나지 않도록, 모든 마우스에 접종하기 전과 후에 접종원의 CFU 농도를 정확하게 측정하는 것이 중요합니다. 셋째, Listeria의 꼬리 정맥 주사는 모든 마우스에 대해 일관되게 수행되어야 합니다. 마지막으로, 말초 혈액을 통해 통과하는 백혈구가 아닌 간 내 면역 세포를 정확하게 측정하기 위해, 간 관류를 통해 비상주 백혈구를 제거해야 합니다. 이러한 단계들이 성공적으로 수행되지 않을 경우, Listeria에 감염된 개별 마우스 간의 세균 부하 및/또는 면역 반응에 원치 않는 변동성이 발생할 수 있습니다.

본 프로토콜의 두 가지 제한 사항은 정맥 주사를 통해 마우스에 감염시키는 연구자의 숙련도와 조직 내 세균 부하의 검출입니다. 한 사람이 다수의 마우스에 주사하는 경우, 냉동 접종원을 해동한 후 시간이 지남에 따라 Listeria의 생존력(즉, CFU 농도)이 감소할 수 있습니다(예: 첫 번째 마우스와 마지막 마우스 주사 사이에 >2시간 소요). 접종원이 손상되기 전까지 몇 마리의 마우스에 주사할 수 있을지는 연구자가 결정해야 합니다. 이 방법의 또 다른 제한 사항은 배양된 조직 균질액의 양이 상대적으로 적기 때문에 Listeria 부하를 100CFU/organ 미만으로 정확하게 측정할 수 없다는 점입니다(예: 그림 3은 검출 한계가 100CFU/organ임을 나타냅니다). CFU/organ의 더 낮은 수치를 더 정확하게 측정하려면, 더 많은 양의 조직 균질액을 배양하여(플레이트당 최대 0.5mL, 여러 플레이트 사용 가능) Listeria 검출을 위해 더 많은 비율의 조직을 샘플링할 수 있습니다. Stomacher를 사용할 수 없는 경우, 단계 7.1-7.2에서 조직 균질기(tissue homogenizer)와 같은 대체 조직 균질화 방법을 사용할 수 있습니다. 실무적인 참고 사항으로, 감염된 마우스의 조직 샘플을 배양하기 위한 37°C 인큐베이터의 공간이 제한적인 경우, HBA 배양 플레이트를 실온에서 2-3일 동안 배양할 수 있습니다(실온에서는 콜로니 성장 속도가 더 느립니다). 하지만 냉동 Listeria 스톡 준비를 위한 배양물을 증식시킬 때는 실온을 사용해서는 안 됩니다.

본 프로토콜은 마우스의 Listeria 감염 특성을 분석하기 위한 기본적인 접근법을 제공하며, EGD 외의 다른 Listeria 균주에도 적용할 수 있습니다. 간과 비장뿐만 아니라 림프절에서도 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있습니다. 두 경우 모두, 이러한 단일 세포 현탁액은 면역 세포 하위 집단 측정 및 분리된 면역 세포의 in vitro 자극을 포함한 다양한 분석에 사용될 수 있습니다. 기본 기술을 숙달하면, 본 프로토콜을 수정하여 Listeria 특이적 T 세포를 분리하거나19, 수지상 세포의 특성을 분석하거나20, 또는 감염 후 특정 시점에서 면역 세포 고갈을 수행함으로써21,22 Listeria에 감염된 마우스의 면역 반응을 더욱 철저하게 분석할 수 있습니다.

공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

저자는 조언과 시약에 대한 안나 Walduck, 크리스티나 건배, 스튜어트 Berzins, 데일 고드프리, Yifan Zhan와 조나단 윌크쉬 감사하고 싶습니다. 이 작품은 소아 당뇨병 연구 재단 (1-2008-602)과 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (575552)에 의해 재정 지원되었다. NW는 호주 대학원 수상에 의해 지원됩니다. 아우는 호주 국민 건강 의학 연구위원회에서 RD 라이트 원정대에 의해 지원됩니다.

재료

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호스 피 한천 기지 제 2 Oxoid CM0271 HBA 플레이트에 대한 한천 기지의 준비
호스 피 (defibrinated) Oxoid HB1000 한천베이스 50~10% 추가
뇌 심장 주입 (BHI) 국물 (10 ML) Oxoid TM456
뇌 심장 주입 탈수 미디어 Oxoid CM1135
96 - 웰 플랫 바텀 플레이트 BD Biosciences 353072
70 μm의 셀 스트레이너 BD Biosciences 352350
소형 페트리 접시 BD Biosciences 351007
Stomacher 80 biomaster 실험실 시스템 슈어드
플라스틱 Stomacher 가방 Sarstedt 86 9,924 530
소 혈청 알부민 시그마 A3912
외과 버퍼 0.1 % (W / V) PBS의 소 혈청 알부민
Isotonic Percoll (PBS에서 33.75 %의 Percoll) GE 헬스케어 17-0891-01 33.75mL Percoll, 3.75mL 10X PBS는 62.5mL 1X PBS는 100mL isotonic Percoll하게
TAC 버퍼 17mM 트리스, 증류수에 140mM 암모늄 클로라이드
FCS / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 10mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 태아 송아지 혈청
외과 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 외과 버퍼 + 5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)
Trypan 파랑 시그마 T6146 PBS에 0.​​4 % (W / V), 필터는 살균
2mL Cryovial 그라 이너 바이오 원 121263
27 gauge/1mL 인슐린 주사기 Terumo 의약품 SS10M2713
바늘 Terumo 의약품 NN - 2516R (25G 5/8in)
NN - 2613R (26G 1/2in)
주사기 Terumo 의약품 SS - 01T (1mL), SS - 053 (5mL), SS - 10 초 (10mL)

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