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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. SPIO-MtbsAb 합성
- 이전에 보고된 방법을 사용하여 SPIO-conjugated 2,2'-(ethylenedioxy)bisethylamine(EDBE)를 합성합니다.
- SPIO-EDBE-숙신산 무수물(SA)을 합성합니다.
- SPIO-EDBE 및 SA(1g, 10μmol)의 알칼리성 용액(5M NaOH, 10mL)을 실온에서 24시간 동안 교반합니다.
- 분자 다공성 멤브레인 튜브(12,000-14,000MW 차단)를 사용하여 증류수 2L를 20회 교환하여 용액을 투석합니다.각 변경에 대해 6시간.
- 마지막으로 1-하이드록시벤조트리아졸 및 (벤조트리아졸-1-일옥시) 트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 촉매로 사용하여 SPIO-MtbsAb를 합성하기 위해 400μL의 4.5mg/mL Mycobacterium tuberculosis 표면 항체(MtbsAb) 400μL에 SPIO-EDBE-SA(4mg/mL의 Fe) 100μL를 추가하고 1-하이드록시벤조트리아졸 및 (벤조트리아졸-1-일옥시) 트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 사용하여 용액을 실온에서 24시간 동안 교반합니다.
- 마지막으로, 겔 여과 크로마토그래피를 통해 결합되지 않은 항체에서 용액을 분리합니다.
- 2.5cm × 33cm 컬럼에 반응 혼합물(5mL)을 로드하고 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액을 사용하여 용리합니다. 비신초닌산 단백질 분석 키트를 사용하여 Ab–나노입자 복합체(즉, 나노프로브)를 확인합니다.
2. 입자 형태 관찰 및 이완 계층 측정
- 100kV의 전압에서 투과 전자 현미경을 사용하여 평균 입자 크기, 형태 및 크기 분포를 조사합니다.
- 복합 분산액을 200메시 구리 그리드에 적하캐스팅하고 실온에서 자연 건조한 후 현미경에 로드합니다.
- 20MHz 및 37.0°C± 0.1°C에서 NMR 이완계를 사용하여 나노프로브의 이완 시간 값(T1및 T2)을 측정합니다.
- 각 측정 전에 이완계를 보정하십시오.
- 반전-복구 및 Carr-Purcell-Meiboom-Gill 펄스 시퀀스를 통해 생성된 8개의 데이터 포인트에서 각각 r1 및 r2 값을 기록하여 r1 및 r2 이완성을 결정합니다.
3. 세포 이미징
- 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 10% 소 태아 혈청, 50μg/mL 겐타마이신 황산염, 100 units/mL 페니실린 G 나트륨, 100 μg 스트렙토마이신 황산염 및 0.25 μg/mL 곰팡이존이 포함된 RPMI 1640에서 인간 단핵구 THP-1을 배양합니다.
- 1시간 동안 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 마이크로 원심분리 튜브(1mL)에 1 × 107개의 활성 단핵구로 사전 배양된 Mycobacterium bovis BCG의 106 콜로니 형성 단위(CFU)로 SPIO-MtbsAb 나노프로브(2mM)를 배양합니다.
- 200 x g에서 원심분리기 튜브를 만들고 상층액을 버립니다. 펠릿을 배지(200μL)에 재용해합니다.
- 빠른 그래디언트 에코 펄스 시퀀스를 사용하여 샘플을 스캔합니다(반복 시간(TR) = 500; 에코 시간(TE) = 20; 플립 각도 = 10°)에서 3.0-T MRI를 통해 나노프로브의 특이성과 민감도를 측정합니다.
4. BCG(Bacillus Calmette–Guérin) 접종
- 동결건조된 백신 또는 박테리아 스톡을 Sauton's 배지에 재구성한 다음 앞서 설명한 대로 적절하게 분산될 때까지 스톡을 식염수로 희석합니다.
- ADIMMUNE (타이완 타이페이)에서 얻은 M. bovis BCG의 약독화 생균주를 접종한다 (Connaught strain; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux)를 마우스당 0.1mL(즉, 107 CFU)의 부피로 마우스의 왼쪽 또는 오른쪽 등쪽 견갑골 피부에 피내 투여합니다. 식염수를 음성 대조군으로 마우스에 주입합니다. BCG 접종 후 매일 동물을 모니터링합니다.
- 세균 접종 1개월 후 이산화탄소 안락사를 사용하여 동물을 희생시킵니다. 피내 접종 부위에서 조직을 채취합니다. 조직을 10% 포르말린으로 고정하고 5-10μm의 연속 절편을 위해 파라핀에 삽입합니다. 조직 단면을 항산성 박테리아의 경우 hematoxylin/eosin 및 Ziehl-Neelsen 염색으로, 철의 경우 베를린 블루로 염색합니다.
5. 생체 내 MRI
- 동물 마취를 위해 케타민(체중 80mg/kg)과 자일라진(체중 12mg/kg)을 생쥐에 피하주사합니다.
- SPIO-TbsAb 프로브(2 nmol/200 μL)를 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다. 프로브 주입 전과 직후, 그리고 나서 30분 동안 5분마다 MR 이미지 마우스를 촬영하여 T2 가중치의 고속 스핀 에코 이미지(TR = 3000; 테 = 90; 시야각 = 8).
- Mtb 육아종 중심과 육아종 부위에 인접한 등 근육의 비교 가능한 위치에서 정의된 관심 영역을 측정하는 신호 강도(SI)를 사용하여 모든 MR 이미지를 정량적으로 분석합니다.
- 조영제의 주입 전(SIpre; control) 및 0-3시간 후(SIpost) 측정을 사용하여 공식을 사용하여 상대적 신호 향상을 계산합니다
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
여기서 SIpre는 강화 전 스캔에서 병변의 SI이고 SIpost는 강화 후 스캔에서 병변의 SI입니다.