형질주입된 포유류 세포의 배치 과성장 배양에서 항체 생산

초록

출처: Elgundi, Z. et al., 치료용 항체의 실험실 규모 생산 및 정제.J. Vis. 특급(2017년)

이 비디오는 안정적으로 형질주입된 포유류 세포를 사용하여 치료용 항체를 생산하는 방법을 보여줍니다. 트립톤 보충제는 세포 분열을 자극하여 과잉 증식을 유발하고 더 높은 항체 수율을 지원합니다. 항체 함유 배지를 수확, 여과 및 추가 사용을 위해 저장합니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜에는 적절한 포유류 발현 벡터를 사용해야 합니다. 여기서, 2개의 발현 카세트를 함유하는 단일 작제물이 사용됩니다(즉, 중쇄 및 경쇄 발현은 별도의 프로모터에 의해 구동됨). Trastuzumab 중쇄 및 경쇄는 이전에 벡터에 복제되었습니다. 이 벡터는 비영리 plasmid 저장소를 통해 얻은 Andrew Beavil의 선물이었습니다.

1. Vector DNA의 회수 및 확장

참고: 벡터 DNA는 Escherichia coli XL-1 Blue 균주에서 부드러운 한천 찌르기 배양으로 접수되었습니다. 벡터는 하이그로마이신 저항성을 가지고 있습니다.

1. 무균 접종 찌르기 또는 고리를 찌르기 배양의 부드러운 한천에 삽입한 다음 분리된 집락을 위해 75μg/ml 하이그로마이신으로 준비된 Luria Bertani(LB) 한천 플레이트를 줄무늬를 만듭니다. 플레이트를 37 ° C에서 18-24 시간 동안 배양하십시오.
2. 단일 콜로니를 75μg/ml 하이그로마이신이 함유된 5ml 훌륭한 육수(TB)에 접종합니다. 225rpm으로 진탕하면서 37°C에서 18-24시간 동안 배양물을 배양합니다.
3. 하룻밤 배양을 사용하여 cryovial에서 800μl의 배양액과 200μl의 80% 글리세롤을 부드럽게 혼합하여 벡터 DNA의 글리세롤 스톡을 준비하고 -80°C에서 동결합니다.
   1. 배플 셰이커 플라스크에 75μg/ml 하이그로마이신이 함유된 100ml TB에 하룻밤 배양 100μl를 추가합니다(즉, 1/1,000 희석). 225rpm 쉐이킹으로 37°C에서 18-24시간 동안 배양물을 배양합니다.
4. 하룻밤 배양 후, 다음의 예외를 제외하고 midi/maxi 준비 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 deoxyribose 핵산(DNA)을 추출 및 정제합니다. 마지막 단계에서 DNA를 물(pH 7.0-8.5)로 용출하거나 재현탁합니다.
5. 260 및 280 nm에서 흡광도 판독으로 DNA의 농도와 순도를 확인한 다음 DNA를 -20 °C에서 보관하십시오.
   참고: 선택 사항(적극 권장): 신원을 확인하기 위해 벡터 특이적 프라이머를 사용하여 DNA를 서열화합니다.

2. HEK-293 세포의 안정적인 transfection

1. 삼각 플라스크에 0.1% 비이온 계면활성제가 보충된 무혈청 배지에서 표준 프로토콜에 따라 HEK-293 세포(현탁 세포)를 성장시키고 유지합니다. 2 x 10⁵ cells/ml를 유지하고 4일마다 계대배양합니다. 37°C에서 5% 이산화탄소(CO₂) 및 120rpm 회전으로 세포를 배양합니다.
   참고: 세포는 transfection 전 최소 4일 동안 배양 상태여야 하며 최대 4주 동안 배양되어야 합니다. 혈청 함유 배지에서 단층으로 성장한 HEK-293 세포도 이 절차에 사용할 수 있습니다.
2. 형질주입 전날, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Media) 2ml에 있는 12웰 플레이트의 웰에서 HEK-293 세포를 3 x 10⁵ cells/ml로 시드합니다. transfection 당일, 세포가 80-90% confluency에 도달했는지 확인합니다.
3. DNA와 폴리에틸렌이민(PEI)을 transfection 배지에서 별도로 희석한 다음 함께 혼합합니다.
   1. 웰당 1.25μg의 벡터 DNA(12웰의 경우 15μg)를 300μl 트랜스펙션 배지에 희석합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   2. 300μl 형질 주입 배지에 2.5μl의 1mg/ml PEI 용액(12웰의 경우 30μl, 즉 DNA와 PEI의 1:2 비율)을 희석합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   3. 희석된 PEI에 희석된 DNA를 첨가하고 부드럽게 혼합한 후 실온에서 15분 동안 배양합니다.
4. 플레이트의 각 웰에 DNA/PEI 혼합물 50μl를 적가합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 트랜스펙션 혼합물을 분배한 다음 플레이트를 37°C, 5% CO₂에서 24시간 동안 놓습니다.
5. 웰당 50μg/ml 하이그로마이신 B를 추가하고 플레이트를 37°C, 5% CO₂로 10일 동안 되돌립니다.
   참고: 10일째가 되면 transfection되지 않은 세포는 사멸되어 플레이트 표면에서 분리되는 반면, 안정적으로 transfection된 세포는 생존 가능하고 플레이트에 부착됩니다.
6. 웰의 배지를 10% FBS(즉, 0.5ml 무혈청 배지 + 1.5ml DMEM = 7.5% 최종 혈청 농도)가 보충된 1/4 부피의 무혈청 배지 및 3/4 부피 DMEM으로 교체하고 4일 동안 배양합니다.
7. 웰의 배지를 10% FBS가 보충된 1/2 부피의 무혈청 배지 및 1/2 부피의 DMEM(즉, 1ml 무혈청 배지 + 1ml DMEM = 5% 최종 혈청 농도)으로 교체하고 4일 동안 배양합니다.
8. 웰의 배지를 3/4 부피의 무혈청 배지와 10% FBS가 보충된 1/4 부피 DMEM(즉, 1.5ml 무혈청 배지 + 0.5ml DMEM = 2.5% 최종 혈청 농도)으로 교체하고 4일 동안 배양합니다.
9. 웰의 배지를 0.1% 비이온 계면활성제(즉, 최종 혈청 농도 0%)가 보충된 2ml의 무혈청 배지로 교체하고 4일 동안 배양합니다.
   참고: 무혈청 적응 동안 세포에 대한 50μg/ml hygromycin B 선택적 압력을 유지합니다. 무혈청 배지에 적응된 세포는 웰 표면에서 분리되어 현탁액으로 뭉칠 수 있습니다. 50 μg/ml hygromycin B를 추가로 보충한 배양 조건은 2.1단계를 참조하십시오.
10. 피펫을 사용하여 12웰 플레이트와 풀 셀의 현탁액 배양액을 별도의 튜브에 부드럽게 혼합합니다.
    1. 혈구계를 사용하여 삼각 플라스크에 2 x 10⁵ cells/ml의 30ml 무혈청 배지에 풀링된 세포와 시드를 열거합니다. 37°C에서 5% CO₂ 및 120rpm 회전으로 세포를 배양합니다. 하위 문화는 4일마다 확장됩니다.
11. 액체 질소에서 동결 보존을 위해 1 x 10⁷ cells/vial에서 10 바이알을 얻기 위해 배양 크기를 필요한 세포 밀도로 계속 확장합니다. 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)를 함유한 무혈청 배지에서 세포를 동결합니다.
    참고: 항체를 포함하는 컨디셔닝된 배지는 단백질 생산을 확인하기 위해 각 하대배양에서 수확하거나 정제 조건을 최적화하는 데 사용할 수 있습니다. 컨디셔닝된 배지를 수확하고 하대배양을 위해 세포를 유지하려면 300 x g에서 5분 동안 배양액을 원심분리한 다음 0.22μm 필터를 통해 상층액을 필터 멸균합니다. 여과된 상등액은 1-2주 동안 4°C에서 보관하거나 장기 보관을 위해 -20°C에서 보관할 수 있습니다.

3. Batch Overgrow 배양을 통한 대규모 항체 생산

참고: 항체 생산은 2.11단계부터 진행될 수 있으며, 여기서 기존 세포는 설정할 배치 과성장 배양 부피를 기반으로 필요한 세포 밀도로 확장됩니다. 그렇지 않으면, 동결 보존에서 해동된 세포는 적절한 세포 밀도와 부피로 확장되면 이 단계에서 시작됩니다. 항체 생산을 최적화하기 위해 다양한 배양 보충제를 사용할 수 있습니다. 항체 수율을 증가시키기 위한 트립톤의 사용은 이 프로토콜에서 입증되었습니다.

1. 2개의 삼각 플라스크에서 100ml 무혈청 배지의 2 x 10⁵ cells/ml의 종자 세포(비보충제 배양액과 영양 보충제 배양액의 항체 수율 비교용). 37 ° C, 5 % CO₂ 및 120 rpm에서 배양.
2. 24시간 후, 영양이 보충된 배양액에 트립톤을 최종 농도 0.5%로 첨가합니다. 무혈청 배지로 보충되지 않은 배양의 부피를 균등화합니다.
3. 8일차부터 세포 생존율을 모니터링하기 위해 혈구계를 사용하여 매일 배양물의 세포 계수를 수행합니다. 세포 생존율이 80% 미만이 되면 배양 상층액을 수확합니다.
   1. 3,000 x g에서 15분 동안 배양물을 원심분리하여 상층액을 수확한 후 0.22μm 필터를 통해 상등액(항체 함유)을 여과 멸균합니다. 상등액을 4°C(단기)에서 보관하거나 -20°C(장기)에서 동결합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
pFUSE 벡터 시리즈	해당 사항 없음	인비보젠	co-transfection이 필요한 별도의 벡터에서 발현되는 heavy 및 light 항체 유전자.
mAbXpress 벡터 시리즈	해당 사항 없음	ACYTE 생명 공학 Pty 주식 회사	co-transfection이 필요한 별도의 벡터에서 발현되는 heavy 및 light 항체 유전자. 참조: Jones, M. L. et al. 재조합 단클론 항체의 신속한 결찰 독립적 재형성 방법. J 면역 방법. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 벡터	해당 사항 없음	해당 사항 없음	무거운 항체와 가벼운 항체 유전자는 각각 단일 벡터에서 별도의 promoter에 의해 구동됩니다. 참고문헌: Dodev, T. S. et al. 재조합 항체의 신속한 클로닝 및 발현을 위한 도구 키트입니다. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS 벡터 시리즈	해당 사항 없음	론자	heavy 및 light 항체 유전자를 가진 multi-cistronic 벡터가 단일 transcript로 동시 발현 및 번역되었습니다.
멀티 시스트로닉 벡터 시리즈 1	해당 사항 없음	해당 사항 없음	heavy 및 light 항체 유전자를 가진 multi-cistronic 벡터가 단일 transcript로 동시 발현 및 번역되었습니다. 참조: Li, J. et al. 재조합 IgG 항체의 포유류 발현을 위한 다양한 벡터 설계에 대한 비교 연구. J 면역 방법. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic 벡터 시리즈 2	해당 사항 없음	해당 사항 없음	heavy 및 light 항체 유전자를 가진 multi-cistronic 벡터가 단일 transcript로 동시 발현 및 번역되었습니다. 참고문헌: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell line. J 바이오테크놀. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-트라스투주마브-IgG1/κ	61883	애드진	하이그로마이신 내성 유전자를 가진 트라스투주맙 항체 유전자를 함유하는 포유류 발현 벡터; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ는 Andrew Beavil의 선물이었습니다.
패스트 미디어 Hygro 한천	FAS-수은-S	조마르 생명 연구	75 μg/ml 하이그로마이신을 함유한 저염 LB 한천을 제조하는 데 사용됩니다.
패스트 미디어 하이그로 TB	FAS-HG-엘	조마르 생명 연구	75 μg/ml 하이그로마이신을 함유한 저염 결핵 육수를 제조하는 데 사용됩니다.
글리세롤, BioXtra, ≥99%	G6279 (영문	시그마-알드리치	물과 오토클레이브로 80%까지 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
Jestar 2.0/LFU 플라스미드 맥시 키트	G221020	아스트랄 사이언티픽	Plasmid Maxi Prep Kit; DNA를 물(pH 7.0-8.5)에서 용출 또는 재현탁합니다.
프리스타일 293-F 셀	제790호-07	생명 기술	HEK-293 세포주는 무혈청 배지에서 현탁 배양에 적응했습니다.
프리스타일 293 익스프레션 미디엄	제12338-018	생명 기술	293-F 세포주와 높은 단백질 발현을 유지하기 위해 특별히 제조된 무혈청 배지.
콜리포르 P188	K4894	시그마-알드리치	비이온 계면활성제; 플루로닉 F-68; 물에 10%까지 준비하고 0.22μm 필터를 사용하여 필터 살균합니다. 4oC에서 보관하십시오.
DMEM, 고혈당	11995-065	생명 기술
열 비활성화 소 태아 세럼	제10082-147	생명 기술
폴리에틸렌이민, 선형, MW 25,000	23966년	폴리사이언스, Inc.	물에 1mg/ml까지 준비합니다. 1M HCl(용액이 투명해짐)로 pH 7.0으로 조정하고 0.22μm 필터를 사용하여 필터 멸균합니다. 사용할 때까지 -80oC에서 보관하십시오.
옵티프로 SFM	제12309-050	생명 기술	Transfection 제형 무혈청 배지
Hygromycin B 솔루션	개미 HG-1	조마르 생명 연구
디메틸설폭사이드(DMSO)	AJA2225	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific
트립톤(카제인 펩톤)	LP0042B	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	PBS에서 20%까지 준비하고 0.22μm 필터를 사용하여 필터 멸균합니다. 4oC에서 보관하십시오.
BLItz 시스템	45-5000	포르테바이오	BLI(Bio-layer Interferometry) 측정에 사용되는 기기입니다.

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