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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 종양 관련 단핵구 유래 수지상 세포의 분리
- 층류 후드에서 CO2 안락사된 마우스의 종양을 제거하고 소 태아 혈청(FBS)이 없는 RPMI 배지에 종양을 배치합니다.
메모: 종양을 제거하기 전에 쥐를 면도하고 70% 에탄올을 분사하는 것이 털로 인한 잠재적인 오염을 최소화하는 것이 좋습니다. 종양이 25 - 40 mm2를 넘지 않도록 해야 하는데, 종양이 클수록 연약하고 세포가 사멸하기 쉬운 수지상 세포(DC)가 적기 때문이다. 더 많은 수의 DC가 필요한 경우 각 마우스에 여러 부위에 종양 세포를 주입할 수 있습니다.
- 멸균 된 층류 후드 아래에서 수술 가위를 사용하여 종양을 작은 조각 (약 1 x 1 mm2)으로 자릅니다.
- 한 마우스의 모든 종양 조각을 5mL의 Hank's balanced salt solution(HBSS), 2mg/mL 콜라겐분해효소 IV 및 0.01mg/mL DNase I.
가 들어 있는 마그네틱 교반 막대가 있는 30mL 멸균 평면 바닥 튜브에 추가합니다.
주의: 골수성 세포는 정상 상태에서도 당화(glycosylation)를 통해 에너지를 생산합니다. 따라서 포도당이 포함된 배지(예: HBSS, Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 및 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM))만 사용해야 하며, 10-15분 동안 포도당이 결핍되면 24시간 이내에 세포사멸 및 세포사멸이 발생합니다. 콜라겐 분해 효소는 그람 양성 박테리아 (Clostridium histolyticum)에 의해 생성되므로 낮은 내독소 콜라겐 분해 효소 IV 만 사용하십시오.
- 자석 교반기를 사용하여 37 oC 인큐베이터에서 약 200 - 400 rpm으로 20-30 분 동안 저어줍니다.
- 5mL의 완전한 배지를 추가하고 격렬하게 다시 현탁합니다.
- 70μm 세포 여과기를 통해 세포를 여과합니다. 세포를 펠릿화하기 위해 4 oC 400 rcf에서 5 - 10 분 동안 원심 분리기.
주의: 일부 종양은 괴사성이며 상대적으로 많은 양의 세포 파편 또는 세포 외 기질을 포함하고 있으므로 효소 분해 직후 세포를 분리하려고 시도하지 마십시오. 15% 밀도 구배 배지에 세포를 적용하여 세포만 얻습니다.
- 9mL의 밀도 구배 배지를 1mL의 10x 인산염 완충 식염수(PBS)와 함께 현탁하여 삼투압을 조정하고 100% Percoll 원액을 얻습니다. 1.5mL 밀도 구배 배지 원액과 8.5mL HBSS를 혼합하고 종양 유래 세포 펠렛과 격렬하게 혼합합니다. 15% 밀도 구배 매체 위에 2mL의 DMEM을 부드럽게 층을 이루고 실온에서 20분 동안 400rcf로 원심분리합니다. 세포가 튜브 바닥에 펠릿을 형성하므로 상등액을 버리십시오.
- 펠릿화된 세포를 2% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(분리 완충액)을 포함하는 10mL HBSS에 다시 현탁시켜 두 번 세척하고 4 oC 400 rcf에서 5-10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
- 광학 현미경에서 trypan blue를 사용하여 혈구계에서 세포를 계수합니다.
- 1 mL 분리 완충액에 1 x 108 세포를 재현탁하고 4 oC에서 30 μL의 CD11b+ 복합 마그네틱 비드와 함께 15분 동안 배양합니다.
주의: CD11c-conjugated beads는 DC를 활성화하고 세포 사멸을 유도할 수 있으므로 사용을 피하십시오. 항-CD16/32 항체로 FcγRII 및 FcγRIIII를 차단하려고 시도하지 마십시오. 차단 항체는 FcγR을 접합하고, 미토겐 활성화 단백질(MAP) 키나아제의 강력한 인산화를 유도하며, DC를 프라임합니다.
- 9mL의 분리 완충액과 원심분리 셀을 400 rcf에서 4oC에서 5 - 10분 동안 첨가하여 과도한 결합되지 않은 비드를 제거합니다.
- 상층액을 흡인하고 1mL 분리 완충액에서 세포를 다시 현탁시킵니다. 미리 세척된 마그네틱 컬럼에 셀을 적용합니다. 3mL의 분리 버퍼로 컬럼을 두 번 세척합니다.
- 자석에서 컬럼을 제거합니다. 6mL의 분리 버퍼를 컬럼에 피펫으로 주입하고 플런저를 눌러 자기 표지된 세포를 멸균 수집 튜브로 씻어냅니다. 400 rcf에서 4 oC에서 5 - 10 분 동안 원심 분리기 셀.
- 1 x 107 세포당 100 μL로 세포를 재현탁시키고 다음 형광단 접합 항체로 염색합니다: 리니지 음성(TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI 및 Ly6G), MHCII, Ly-6C.
- 측면 산란(SSC) 및 전방 산란(FSC)을 사용하여 작은 세포를 게이팅하여 세포를 분류하고 5ng/mL GM-CSF - 대식세포가 플레이트에 부착될 수 있도록 37°C에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 느슨하고 부착되지 않은 세포를 새로운 배양 접시로 옮깁니다.
메모: 마우스 MoDC는 CD11b+/CD11c+/MHCIIhi/Ly6Clo/int로 정의됩니다. Ly6C의 발현은 종양 모델마다 크게 다를 수 있으며, 일부 모델(예: LMP)에서는 MoDC에 Ly6C 발현이 전혀 없습니다. 하나의 100 mm3 B16F10 종양은 일반적으로 5 x 104의 DC를 포함하므로 약 4 - 5 x 106 개의 총 세포가 있습니다. 이 세포 중 10 - 15%는 면역 세포이고 8 - 10%는 MoDC입니다. DC 수를 늘리는 것은 여러 부위에 종양이 있는 마우스를 주입함으로써 달성할 수 있습니다. 다른 골수성 세포는 CD11c 및 Ly6C와 같은 마커를 발현할 수 있으므로 작은 SSC/FCS 세포만 분류합니다.
선택적: 종양 침윤 단핵구를 Ly6Chi를 발현하고 MHCII에 대해 음성인 작은 SSC/FSC 세포로 분류합니다. 그 후, DC를 얻기 위해 50ng/mL GM-CSF로 체외에서 단핵구를 배양합니다.
2. 종양-IgG 면역 복합체의 제조
- 75cm2 배양 플라스크에서 완전한 DMEM 배지에서 70% confluence로 종양 세포를 배양합니다.
- 0.25% 트립신/EDTA 2mL를 첨가하여 배양 플라스크에서 세포를 분리하고 광학 현미경으로 세포 형태를 모니터링하여 과도한 트립신화를 방지합니다.
- 트립신 분해를 억제하기 위해 8mL의 완전 배양 배지(트립신 2mL당)를 추가하고 4 oC, 400 rcf에서 5-10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
메모: 상용 PCR 키트를 사용하여 종양 세포에 마이코플라스마가 있는지 확인합니다. LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 분석을 사용하여 그람 음성 박테리아 및 진균 내독소를 테스트합니다. 혈청은 0.22μM까지 여과되어야 하며 9 Code of Federal Regulations 바이러스에 대해 테스트되어야 합니다. 또한 100 - 200 μL를 LB 한천 또는 육수에 떨어뜨려 배양 배지 및 혈청을 테스트하고 37 oC에서 2일 동안 배양합니다.
- 트립신과 혈청 잔여물을 10mL PBS에 다시 현탁시키고 400 rcf에서 5-10분 동안 원심분리하여 세포를 다시 세척합니다.상층액을 흡인하고 세척을 2회 더 반복합니다.
- 실온에서 10분 동안 1.8% 완충된 파라포름알데히드로 세포를 고정합니다.
- 10mL PBS에 다시 현탁시키고 4 oC 400 rcf에서 5 - 10분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다.
- 상층액을 흡입하고 두 번 더 세척을 반복합니다.
선택적: 종양 흡수 분석의 경우, 1μM 카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(CFSE)를 함유한 PBS에서 37°C에서5분 동안 세포를 배양하여 세포를 라벨링할 수 있습니다. 그런 다음 CFSE는 얼음에서 10분 동안 완전한 매체로 담금질됩니다. 세포는 잔류 염료를 제거하기 위해 2% 혈청이 함유된 PBS로 광범위하게 세척해야 합니다.
- FACS(Fluorescence-activated Cell Sorting) 완충액(2% FCS + 5mM EDTA가 보충된 PBS) 및 0.5μg/mL의 항-CD16/32에서 세포를 재현탁하여 잠재적인 비특이적 단백질-단백질 상호 작용을 차단합니다. U자형 96웰/플레이트, 1 x 10, 100μL당5셀 농도.
- 5 μg - 5 ng/1 x 105 세포 범위의 다양한 종양 결합 항체 희석액을 추가합니다. 얼음 위에서 접시를 15-20분 동안 배양합니다.
메모: IgG 항체는 설명된 바와 같이 단백질 A 컬럼에 대한 미숙한 20-24주 된 암컷 마우스의 혈청에서 분리되었습니다.
- 150μL의 PBS를 첨가하고 4 oC 400 rcf에서 5 - 10분 동안 플레이트를 원심분리하여 세포를 세척합니다.
- 상층액을 버리고 세척을 두 번 반복합니다. 형광단 접합 2차 항체를 포함하는 100μL FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다. 얼음 위에서 플레이트를 20분 동안 배양합니다.
- 200μL의 FACS 완충액을 추가하고 400 rcf에서 5 - 10분 동안 플레이트를 원심분리하여 세포를 세척합니다. 상등액을 버리고 세척을 반복합니다.
- 유세포 분석법으로 종양 결합을 분석하고 세포를 코팅하는 데 필요한 최소 농도를 측정합니다.
메모: 염색된 종양 세포의 평균 형광 강도(MFI)가 동형(isotype) 대조군보다 5배 이상 증가하지 않는 항체는 후속 기능 분석에 사용되어서는 안 됩니다.
3. Tumor-IgG IC를 사용한 MoDC 활성화
- 섹션 2.1에서 2.4.3에 설명된 대로 최소 IgG 농도로 종양 세포를 코팅합니다.
- MoDC를 종양 IC로 활성화하기 하루 전에 GM-CSF가 포함된 MoDC 배양 배지를 교체합니다. 이렇게 하려면 배지를 부드럽게 흡인하고 예열된 완전 배양 배지로 세포를 한 번 세척합니다.
메모: 분리된 성숙한 종양 관련 MoDC는 GM-CSF 없이 완전한 배지에서 분류한 후 IC로 활성화하기 전에 최소 2 - 3시간(또는 하룻밤) 동안 배양해야 합니다.
- 종양 흡수 분석의 경우, CFSE 표지된 종양 IC를 1:5(IC: MoDC)의 비율로 MoDC에 첨가하고 1 x 106 DC당 1mL의 완전한 배지에서 12 - 16시간 동안 밤새 배양합니다.
- MoDC 활성화 실험의 FACS 분석을 위해 1:1(IC: MoDC) 비율로 tumor-IC를 추가하고 12 - 16 h.
동안 하룻밤 동안 배양합니다.
메모: MoDC가 1μg/mL의 LPS 또는 기타 TLR 작용제로 자극되는 positive control well을 포함하는 것이 좋습니다.
- 하룻밤 동안 활성화한 후 상층액을 흡인하고 분리 완충액 또는 10mM EDTA HBSS로 세포를 세 번 부드럽게 세척합니다.
- 플레이트에서 DC를 분리하려면 10mM EDTA를 함유한 1mL HBSS에서 2 - 3분 동안 세포를 배양하고 격렬한 피펫팅으로 세포를 분리합니다.
- 400 rcf에서 원심분리기 세포를 만들고 2% FCS, 5mM EDTA(FACS 버퍼) 및 0.5μg의 차단 항체가 보충된 90μL PBS에서 1 x 106 DC를 다시 현탁합니다. 얼음 위에서 5 - 10 분 동안 배양합니다.
- 10μL의 염색 항체 혼합물을 세포에 추가하고 얼음에서 15분 동안 배양합니다.
- 세포에 2mL FACS 완충액을 추가하고 4 oC 400 rcf에서 5 - 10분 동안 원심분리합니다.
- 200μL FACS 완충액에서 세포를 다시 현탁합니다.
- 샘플을 실행하기 1 - 2분 전에 0.5 - 1 μg/mL의 DAPI를 첨가하여 분석에서 죽은 세포를 제외합니다. MoDC는 10-15분 이내에 DAPI를 흡수하므로 DAPI를 과도하게 배양하지 마십시오.