마우스 모델에서 불변 자연 살해 T 세포 분리

초록

출처: Meng, M., et al. 포도당-6-인산염 이소머라제(G6PI)-유도된 RA 마우스에서 iNKT 세포의 입양 면역요법.J. Vis. 특급(2020년)

이 영상은 불변 자연적인 살해 T 세포, 일컬어 iNKT 세포를 고립시키기를 위한 방법을 설명합니다. 절차는 비장에 있는 iNKT 세포의 활성화 그리고 증식을 자극하기 위하여 합성 당지질을 쥐로 주입하는 것으로 시작됩니다. 연속적으로, 단 하나 세포 현탁액은 비장에서 준비되고 형광단으로 레테르를 붙인 iNKT 세포 인식 복합물로 배양되고, 자석 구슬 근거한 별거가 뒤이어, iNKT 세포를 고립시키기 위하여 배양됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 입양 세포질 치료를 가진 불변 자연적인 살해 T 세포 (iNKT 세포) 얻기

1. iNKT 세포의 방향성 유도
   1. 정상 마우스에 α-갈락토실세라마이드(α-GalCer)(체중의 0.1mg/kg)를 복강내 주사합니다.
2. iNKT 세포의 분리
   1. 모델링 3일 후, 마취를 위해 1% 펜토바르비탈 나트륨(체중 50mg/kg)을 마우스에 복강내 주사합니다. 적절하게 마취된 마우스는 발가락 꼬집음에 대해 뒷발 철수 반응을 보이지 않습니다.
   2. DBA/1 마우스의 비장에 α-GalCer를 복강내 주입한 후 분리합니다. 200메쉬 체에서 비장을 절단하고 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
   3. 세포 현탁액을 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고 200 x g에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 반복하다.
   4. 1mL의 전혈 및 조직 희석 용액으로 세포를 재현탁합니다. 마우스 림프구 분리 배지 3mL를 첨가한 다음 실온에서 300 x g에서 20분 동안 세포를 원심분리합니다.
   5. 유백색 림프구층(즉, 위에서 두 번째 층)을 수집하고, PBS로 2x 세척한 다음 자동 세포 계수기로 계수합니다.
3. iNKT 세포의 정화를 위한 자석 활성화된 세포 분류 (MACS) 긍정적인 선택 전략
   메모: CD1d 사량체의 전처리를 위해 α-Galcer 1 mg/mL를 0.5%의 Tween-20 및 0.9%의 NaCl로 200 μg/mL로 희석하고, 생성된 용액 5 μL를 CD1d 사량체 용액 100 μL에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 동안 배양하고, 사용을 위해 4°C에 두었다. T 세포 수용체(TCR) β을 탈이온수로 80배 희석하였다. 다른 모든 항체는 원액으로 사용하였다.
   1. 10⁷ 세포를 100 μL의 4 ° C PBS로 재현탁하고, 10 μL의 α-GalCer-loaded CD1d Tetramer-phycoerythrin (CD1d Tetramer-PE)을 첨가하고, 어둠 속에서 15 분 동안 4 ° C에서 배양합니다.
   2. PBS로 세포를 2x 세척하고 80μL의 PBS에 재현탁합니다.
   3. 20 μL의 anti-PE-MicroBeads를 첨가하고 4 °C에서 20분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
   4. PBS로 2회 세척하고 500μL의 PBS로 세포를 재현탁합니다.
   5. 분류 컬럼을 MACS 분류기의 자기장에 놓고 500μL의 PBS로 헹굽니다.
   6. 1.3.4단계의 세포 현탁액을 분류 컬럼에 추가하고, 플로우스루를 수집하고, PBS 버퍼로 3x 헹굽니다.
   7. 자기장을 제거하고 분류 컬럼에서 세포를 수집합니다. 이 시점에서, 분류 란에 PBS 완충액의 1개 mL를 추가하고 레테르를 붙인 세포를 수집 관에 몰고 순화한 iNKT 세포를 얻기 위하여 빨리 일정한 압력으로 플런저를 밉니다. 자동화된 세포 계수기로 계수합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Anti-PE 마이크로비즈	밀테니	Tel.: 130-048-801	독일
열	밀테니	석사	독일
극저온 원심분리기	베크만	알레그라® X-15R	미국
마우스 CD1d Tetramer-PE	증권 시세	TS-MCD-1	일본
마우스 percoll	솔라바이오	P8620	중국
광학 현미경	올림푸스	올림푸스-II	일본