Enhancing Viral Transduction in Natural Killer cells Using a Cationic Polymer(양이온성 고분자를 이용한 자연살해세포에서의 바이러스 전달(Viral Transduction in Natural Killer Cells Using a Cationic Polymer)

초록

출처: Nanbakhsh, A., et al. 덱스트란은 쥐와 인간 1차 NK 세포의 렌티바이러스 전달 효율을 향상시킵니다. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 자연살해(NK) 세포에서 양이온 고분자 매개 바이러스 전달에 대한 분석을 보여줍니다. 세포는 형광 단백질을 인코딩하는 형질전환 렌티바이러스 벡터로 배양됩니다. 양이온성 폴리머를 추가하면 바이러스가 세포에 부착하고 RNA를 숙주 게놈에 통합하여 형광 단백질을 발현할 수 있습니다. 형광은 형질주입의 폴리머 유도 향상을 평가하기 위해 정량화됩니다.

프로토콜

1. 쥐와 인간 1차 NK 세포의 렌티바이러스 형질도입

1. 5, 10 및 20 감염 다중성(MOI)에서 녹색 형광 단백질(GFP) 렌티바이러스 상등액이 존재하고 Pb(8μg/mL), PS(8μg/mL) 또는 덱스트란(8μg/mL)이 있는 상태에서 0.5 × 10⁵/mL의 배지로 24웰 플레이트에 마우스 또는 인간 1차 NK 세포를 현탁합니다.
2. 1,000 × g에서 60분 동안 플레이트를 원심분리합니다.
3. 상등액을 디캔팅하지 않고 5.2% CO₂가 주입된 37°C 인큐베이터에서 하룻밤(16-18시간) 세포를 배양합니다.
4. 10mL의 PBS로 세척하고 인터루킨 2(IL-2, 300 U/mL)가 있는 상태에서 완전한 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배양 배지 2mL에 재현탁합니다.
5. 7일째에 플라스크를 부드럽게 두드려 형질도입된 NK 세포를 채취합니다.
   1. 하룻밤 사이에 2.5μg/mL 농도의 단백질 흡수율이 높은 폴리스티렌 플레이트를 코팅하여 플레이트 결합 반자연살해군 2D(NKG2D) (A10) mAb의 적정 농도로 수확된 세포를 활성화합니다.
   2. 1차 NK 세포를 추가하기 전에 100μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 각 웰을 3회 세척합니다.
6. 활성화 후 16-18시간 사이에 다중 채널 피펫을 사용하여 배양 상등액을 수집하여 인터페론 감마(IFN-γ)와 같은 사이토카인을 정량화합니다. 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 키트와 함께 제공되는 재조합 사이토카인을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다.
7. annexin-V/7-amino-actinomycin D (7-AAD) 염색을 사용하여 NK 세포 생존율을 테스트하고 유세포 분석기를 사용하여 형질전환된 NK 세포 중 괴사 세포의 비율을 측정합니다.
   1. 이 분석을 수행하려면 형질도입 4일 후 쥐와 인간 NK 세포를 채취하고, 500 × g의 10mL의 차가운 PBS로 각각 5분씩 2회 세척한 후 Annexin-V(PE)/7-AAD 키트로 배양합니다.
8. 적절한 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 살아있는 세포 집단을 선택하고 바이러스 형질도입의 척도로 GFP(플루오레세인 이소티오시아네이트[FITC] 채널)의 발현을 분석합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
덱스트란	시그마-알드리치	90-64-91-9
폴리브레렌(Pb)	시그마-알드리치	TR-1003
프로타민 설페이트(PS)	시그마-알드리치	P3369
RPMI1640	코 닝	10-040-이력서
인터페론 감마 (IFN-γ )	이바이오사이언스	Tel.: 14-7311-85
Propidium lodide 염색 용액	BD (영어)	51-66211E
리포펙타민 3000	써모 피셔	L3000015
이소플루란	불사조	재질 보기 NDC 57319-559-05
293T 셀	증권 시세	CRL-3216
T75 플라스크	코 닝	430641U
ELISA 키트	에바이오사이언스	전화: 00-4201-56