$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
참고: 장갑을 착용하고 모든 단계를 수행하십시오. 세포의 오염을 방지하기 위해 층류 후드 아래에서 모든 transfection 단계를 수행합니다. mRNA로 작업하기 전에 피펫과 같은 모든 기기와 모든 표면을 70% 에탄올 및/또는 RNAse 분해 계면활성제로 세척합니다(재료 표). 모든 반응 튜브가 RNAse-free 및 steril 상태인지 확인합니다. 희석에는 RNAase가 없는 멸균수만 사용하십시오. 필터가 있는 피펫 팁만 사용하십시오. 모든 파이펫팅 단계 후에 파이펫 팁을 교체하십시오.
1. DNA 템플릿의 생성
참고: 이 프로토콜을 사용하는 in vitro mRNA transcription을 위한 DNA 템플릿에는 RNA 중합효소의 도킹을 허용하는 T7 promotor 서열이 포함되어야 합니다. 관심 단백질의 DNA 염기서열을 포함하는 플라스미드가 이미 관심 염기서열의 바로 업스트림에서 올바른 배향의 T7 promotor 염기서열을 포함하고 있는 경우, 플라스미드의 선형화(단계 1.1 참조)를 수행해야 합니다. 그렇지 않으면 중합효소 연쇄 반응(PCR, 단계 1.2 참조)에 의해 관심 서열에 T7 promotor를 부착합니다.
- T7 promotor-containing plasmids의 선형화
- 관심 서열의 정지 코돈(stop codon)의 다운스트림을 절단하는 제한 효소(restriction enzyme)로 분해하여 올바른 배향의 T7 promotor 서열을 이미 포함하고 있는 플라스미드를 선형화합니다. 그렇지 않으면 관심 있는 시퀀스 후에 전사가 제대로 종료되지 않습니다.
알림: 끝이 뭉툭하거나 5' 돌출부를 남기는 제한 효소를 사용하는 것이 가장 좋습니다.
- undigested plasmid DNA와 digested plasmid DNA의 agarose gel 전기영동을 통해 plasmid의 완전한 선형화를 확인합니다.
- DNA 정제 키트를 사용하여 in vitro mRNA 전사를 위한 DNA 템플릿으로 사용하기 전에 선형화된 플라스미드 DNA를 정제합니다(Table of Materials).
- PCR에 의하여 T7 promotor의 부착
- 다음 성분을 포함하는 전방 프라이머를 사용하십시오 (5'에서 3'까지 표시된 순서로) : 프로모터의 약 5 무작위 bp 상류 (예 : GAAAT); T7 프로모터 서열 (TAATACGACTCACTATAG); 증가된 전사 효율 (GG)을 위한 2개의 추가 Gs; 시작 코돈을 둘러싼 플라스미드 서열과 상동성인 타겟 서열 특이적 부분.
메모: KOZAK 서열 및 시작 코돈의 3-6 bp 상류, KOZAK 서열 및 시작 코돈 (일반적으로 GCCACC ATG G), 시작 코돈의 12-18 bp 하류로 구성되어야합니다. 관심 서열이 이미 KOZAK 서열 또는 시작 코돈을 포함하지 않는 경우, 이들은 단순히 프라이머 서열에 포함시킴으로써 이 단계에서 부착될 수 있습니다.
- 순방향 프라이머의 tm은 타겟 서열과 상동적인 부분을 고려해서만 계산합니다.
- 이량체/헤어핀 형성을 평가하려면 50bp를 쉽게 초과할 수 있는 전체 프라이머 염기서열을 사용하십시오.
- 정지 codon.
의 하류 어딘가에 있는 역 프라이머를 사용하십시오.
참고: 관심 염기서열에 정지 코돈이 이미 포함되어 있지 않은 경우, 이 단계에서 단순히 프라이머 염기서열에 포함시켜 부착할 수 있습니다.
- 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 교정과 함께 충실도가 높은 중합효소를 사용하여 PCR을 수행합니다(Table of Materials).
- 아가로스 젤 전기영동으로 단일 생성물과 앰플리콘 크기의 생성을 확인합니다(예: 1% 아가로스 겔 및 100V 정전류 사용).
- DNA 정제 키트를 사용하여 in vitro messenger ribonucleic acid(mRNA) 전사를 위한 deoxyribonucleic acid (DNA) template로 사용하기 전에 PCR 산물을 정제합니다.
2. mRNA 생성
- in vitro mRNA transcription kit의 모든 구성 요소를 해동합니다(재료 표 참조). 2,000 x g에서 5초 동안 소용돌이치고 2초 동안 스핀 다운합니다. 사용할 때까지 얼음에 넣어 보관하십시오.
- 다음 순서로 0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 시험관 내 mRNA 전사를 위한 반응 혼합물을 준비합니다(총 부피 40 μL): 10x 역캡 유사체/뉴클레오시드 삼인산(ARCA/NTP) 혼합물 20 μL(시험관 mRNA 전사 키트에 포함); 5-메틸-시티딘 트리포스페이트(5-mCTP) 0.25 μL(최종 농도(f.c.)는 1.25 mM, 총 CTP의 50%임), 0.25 μL의 pseudo-uridine triphosphate(pseudo-UTP)(fc는 1.25 밀리미터; 총 UTP의 50%). DNA 템플릿의 X μL; 2 μL의 T7 RNA 중합효소 혼합물(in vitro mRNA transcription kit에 포함); RNAse-free H2O.
의 Y μL
참고: X는 최소 1μg의 DNA를 포함하는 부피입니다. 예를 들어, 625ng/μL 원액에서 1.6μL를 추출할 수 있습니다. Y는 총 부피 40μL에 대한 예비 부피입니다.
- 2,000 x g에서 5초 동안 소용돌이치고 2초 동안 스핀 다운합니다. 체외 전사를 위해 37°C에서 30분 동안 400rpm으로 열 혼합기로 배양합니다.
- 그런 다음 2 μL의 DNase I을 반응 혼합물에 직접 첨가하여 템플릿 DNA를 제거합니다. 2,000 x g에서 5초 동안 소용돌이치고 2초 동안 스핀 다운합니다.
- 37°C에서 15분, 400rpm, 써멀 믹서에서 배양합니다. 대조군 젤을 위한 2 μL의 분취액을 가지고 가고 (단계 3.3) -80 °C에 저장하십시오.
- 폴리(A) 테일링의 경우, 이전 반응 혼합물에 다음 성분을 직접 추가합니다(최종 부피 50 μL까지): 5 μL의 10x 폴리(A) 중합효소 반응 완충액 및 5 μL의 폴리(A) 중합효소(둘 다 in vitro mRNA transcription kit에 포함됨). 2,000 x g에서 5초 동안 소용돌이치고 2초 동안 스핀 다운합니다.
- 써모믹서에서 37°C에서 400rpm으로 30분 동안 혼합물을 배양합니다. 대조군 젤을 위한 2 μL의 분취액을 가지고 가고 (단계 3.3) -80 °C에 저장하십시오.
- mRNA의 5'-말단의 탈인산화를 위해 다음 성분을 이전 반응 혼합물에 직접 추가합니다(최종 부피 60μL까지): RNAse-free H2O 3μL, 10x 남극 인산가수분해효소 반응 완충액 6μL, 남극 인산가수분해효소 3μL(60μL 반응 부피를 위한 15개 단위). 2,000 x g에서 5초 동안 소용돌이치고 2초 동안 스핀 다운합니다.
- 열 혼합기에서 37 ° C에서 30 분 동안 400 rpm으로 혼합물을 배양합니다.
- 남극 포스파타아제를 80°C에서 2분 동안 배양하여 가열
메모: 이상적으로는 별도의 열 혼합기를 사용하고 첫 번째 믹서가 원하는 온도에 도달할 때까지 기다리지 마십시오.
3. mRNA 정제
- 전용 RNA 정제 키트(Table of Materials)를 사용하여 in vitro 전사된 mRNA를 정제합니다.
- 2.10단계의 mRNA 반응 혼합물에 X μL의 용출 용액을 추가합니다. 5회 반전하여 혼합합니다. 결합 용액 농축액 300μL를 첨가합니다. 부드러운 피펫팅으로 5회 혼합합니다.
참고: X는 총 부피 100μL에 대한 예비 부피입니다. 예를 들어, 60μL mRNA 반응 혼합물에 40μL 용출 용액을 추가합니다.
- 100μL의 RNAase-free 에탄올을 추가합니다. 부드러운 피펫팅으로 5회 섞습니다.
- 제공된 수집 튜브 중 하나에 필터 컬럼을 놓습니다. mRNA 반응 혼합물을 필터에 닿지 않고 필터 중앙으로 부드럽게 옮깁니다. 15,000 x g의 원심분리기를 실온(RT)에서 1분 동안 사용합니다.
- 필터 컬럼을 조심스럽게 들어 올리고 수집 튜브의 관통 튜브를 버립니다. 필터 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 놓습니다.
- 500μL의 세척 용액을 추가합니다(세척 용액을 처음 사용하기 전에 20mL의 RNAase-free 에탄올을 추가하는 것을 잊지 마십시오).
- RT에서 15,000 x g에서 1분 동안 원심분리기. 3.1.4-3.1.6단계를 반복하여 한 번 더 세척합니다.
- RT에서 1분 동안 최고 속도(17,900 x g)로 원심분리기를 사용하여 필터 컬럼에서 잔류 유체를 제거합니다. 수집 튜브에서 필터 컬럼을 조심스럽게 꺼냅니다. 필터 컬럼을 새 수집 튜브에 놓습니다.
- 필터를 건드리지 않고 필터 중앙에 50μL의 용리 완충액을 추가합니다. 65 °C에서 열 혼합기에서 10분 동안 배양합니다.
- RT에서 1분 동안 15,000 x g에서 원심분리기.필터 컬럼을 제거하고 폐기합니다.
- 예를 들어, 260 및 280 nm에서 흡광도를 측정하기 위해 마이크로볼륨 분광 광도계를 사용하여 용리된 mRNA의 농도와 순도를 측정합니다.
참고: A260/A280 비율이 1.8-2.1이면 고도로 정제된 mRNA를 나타냅니다.
- 변성 조건에서 아가로즈 젤 전기영동으로 2.5단계 및 2.7단계의 부분 표본을 분석하여 단일 생성물, 올바른 전사 길이 및 폴리(A) 테일링의 존재를 확인합니다(예: 20mM 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산[MOPS], 5mM 아세트산나트륨, 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 20% 포름알데히드를 함유한 1.2% 아가로스 겔을 사용하고 20mM 걸레에서 실행합니다. 100V 정전류에서 5mM 나트륨 아세테이트, 1mM EDTA 및 0.74% 포름알데히드).
- 정제된 mRNA를 transfection까지 -80 °C의 용출 튜브에 보관합니다. transfection을 위해 소량의 mRNA만 사용하는 경우 반복되는 동결-해동 주기를 피하기 위해 mRNA를 분취하십시오.
참고: mRNA는 -80°C에서 약 1년 동안 보관할 수 있습니다.
4. 대식세포 준비
- C57/BL6 마우스(동성 및 6-24주 된 마우스 사용)를 경추 탈구로 안락사시킵니다.
참고: 동일한 마우스를 일차 대식세포(PM)의 분리(4.2단계) 및 BMDM 생성(4.3 및 4.4단계)에 사용할 수 있습니다. PM을 분리하려면 최소 두 개의 마우스를 사용하십시오. BMDM만 생성해야 하는 경우 일반적으로 마우스 한 개면 충분합니다.
- 복막 대식세포의 면역자기 농축.
- 10mL 주사기에 0.9 x 40mm 캐뉼라에 8mL의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)와 2mL의 공기를 채웁니다. PBS로 복막강을 세척합니다. 공기는 PBS의 누출을 최소화하는 기포를 형성합니다.
- 동일한 주사기로 복막 세척을 빠르게 채취하여 50mL 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 필요한 경우 여러 마우스의 복막 세포를 결합합니다. 세포 현탁액을 얼음 위에 두십시오.
- 650 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리 세포 현탁액. 상등액을 버리고 세포 펠렛을 0.2% NaCl 5mL에 30초 동안 재현탁하여 적혈구를 용해시킵니다.
- 1.6% NaCl 5mL를 총 부피 10mL에 추가하여 등장성 조건을 재구성합니다. 650 x g에서 4°C에서 5분간 원심분리기.
- 상층액을 버리고 복막 세척 1개당 97.5μL의 자기 세포 분류(MCS) 완충액(2mM 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA], PBS의 0.5% 소 혈청 알부민[BSA])에 세포 펠릿을 재현탁합니다(예: 3개의 마우스를 플러시한 경우 292.5μL에 재현탁).
- 97.5 μL의 세포 현탁액당 CD11b 특이적 항체에 접합된 2.5 μL의 상자성 비드를 추가합니다(예: 7.5 μL에서 292.5 μL 추가).
- 오비탈 쉐이커에서 150rpm으로 15분 동안 얼음 위에서 배양합니다.
- 650 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리 세포 현탁액을 투여한 후 상층액을 버리고 세포 펠렛을 1mL의 MCS 완충액에 재현탁합니다.
- 총 부피 5mL에 MCS 완충액 4mL를 추가하고 위아래로 부드럽게 3회 피펫팅하여 세포를 세척합니다.
- 4.2.8 및 4.2.9 단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번의 세척 단계를 수행합니다.
- 세척 단계에서 LS 컬럼을 마그네틱 셀 분리기에 배치합니다(재료 표 참조). MCS 완충액 3mL로 컬럼을 헹굽니다.
메모: 거품은 기둥을 막을 수 있으므로 피하십시오.
- 세포 펠릿을 1mL의 MCS 완충액에 재현탁합니다. 총 부피 4 mL에 MCS 완충액 3 mL를 추가하고 위아래로 3회 피펫팅하여 혼합합니다.
- 4mL의 세포 현탁액을 헹궈진 LS 컬럼으로 옮깁니다.
알림: 다시 말하지만, 거품은 열을 막을 수 있으므로 피하십시오.
- 컬럼의 저장소가 완전히 비워 질 때까지 기다리십시오. 컬럼이 물방울이 떨어지는 것을 멈출 때까지 추가 유체를 추가하지 마십시오.
- 컬럼에 MCS 완충액 3mL를 추가합니다. 그런 다음 컬럼의 저장소가 완전히 비워 질 때까지 기다립니다. 4.2.15단계를 두 번 더 반복합니다.
- LS 컬럼을 15mL 코니컬 원심분리 튜브에 넣습니다. MCS 완충액 5mL를 컬럼에 도포합니다. 2mL의 액체가 컬럼을 통과할 때까지 기다린 다음 플런저를 사용하여 나머지 분획을 튜브로 부드럽게 밀어 넣습니다.
- 650 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리 세포 현탁액을 버리고 상층액을 폐기합니다.
- 10% 열 비활성화 태아 송아지 혈청(FCS)(DMEM+FCS)이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) 1mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- Neubauer 계수 챔버의 트리판 블루 용액에서 계수하고 DMEM+FCS의 시드 세포를 배양 플레이트에 계수하여 생존 가능한 세포의 수를 측정합니다.
참고: 평평한 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 100,000개 세포/웰의 밀도로 PM을 시드합니다. 조직 배양 처리된 플레이트는 PM에서 분리될 수 없으므로 사용하지 마십시오. 대신 처리되지 않은 플레이트를 사용하십시오.
- BMDM의 생성
- 가위를 사용하여 뒷다리의 피부와 근육을 제거합니다. 70% 에탄올에 짧게 담가 각 다리를 씻으십시오.
- 다리를 분리하고 가위로 잘라 대퇴골과 경골의 양쪽 끝을 엽니다.
- 0.6mm x 30mm 캐뉼라로 채워진 5mL 주사기에 5mL의 매우 낮은 내독소(VLE) RPMI 1640을 채우고 열린 뼈에서 골수를 배양 접시로 씻어냅니다.
- 필요한 경우 4.3.1-4.3.3 단계를 반복하여 여러 마우스의 골수를 결합합니다. 골수를 50mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 골수 현탁액을 650 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 5mL의 적혈구 용해 완충액(8.3% 염화암모늄, NH4Cl, 0.1 M Tris)에 세포 펠렛을 재현탁하고 RT에서 5분 동안 배양하여 적혈구를 용해합니다.
- 세포 현탁액을 650 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 10% FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% HEPES, 1% 피루브산 나트륨 및 10ng/mL 재조합 대식세포 집락자극인자(M-CSF)(RPMI+++++)가 보충된 VLE Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지 1mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 총 부피 4 mL에 RPMI+++++ 5 mL를 추가합니다.
- 각 접시에 92mL의 RPMI+++++ 배지를 피펫으로 주입하여 마우스당 캠이 있는 5개의 16mm x 16mm 처리되지 않은 페트리 접시(재료 표 참조)를 준비합니다.
- 1mL의 세포 용액을 준비된 5개의 배양 접시에 옮기고 37°C 및 5%CO2에서 배양합니다.
- 4일 후 RPMI+++++ 4mL를 첨가하여 세포에 영양을 공급합니다. 6-7일 후, 골수 세포는 BMDM으로 완전히 분화됩니다.
- BMDM 수확
- 배양 접시에서 매체를 완전히 제거하십시오. 각 접시에 PBS에 따뜻한 0.2mM EDTA 5mL를 추가합니다.
- 셀 스크레이퍼로 플레이트 전체를 부드럽게 긁어 BMDM을 분리합니다. 50mL 코니컬 원심분리 튜브에 세포 현탁액을 결합합니다.
- 5개의 접시를 모두 다시 세척하십시오. 5가지 요리 모두에 PBS에 5mL의 따뜻한 0.2mM EDTA를 동일한 부피로 사용합니다. 이 세포 현탁액을 이전 단계의 현탁액과 결합합니다.
- 650 x g에서 4°C에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 10% FCS, 1% HEPES, 1% 피루브산 나트륨 및 10ng/mL 재조합 M-CSF가 보충되지만 항생제는 사용하지 않음(RPMI++++) 1mL의 VLE RPMI 1640 배지에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
- Neubauer 계수 챔버에서 트리판 블루 용액을 계수하고 RPMI++++의 시드 세포를 배양 플레이트에 계수하여 생존 가능한 세포의 수를 결정합니다.
메모: 평평한 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 최대 50,000 cells/well 밀도로 BMDM을 시딩합니다. 조직 배양 처리된 플레이트는 BMDM이 거의 분리되지 않으므로 사용하지 마십시오. 대신 처리되지 않은 플레이트를 사용하십시오.
5. mRNA를 이용한 대식세포의 transfection
- mRNA transfection buffer의 필요한 부피를 계산합니다.
메모: 필요한 mRNA transfection buffer의 부피는 well 크기에 따라 다릅니다: 6-well plate에서 transfection에는 200 μL, 12-well plate에는 100 μL를 사용합니다. 피펫팅 손실로 인해 항상 약간의 여유 부피를 추가하십시오(그러나 mRNA의 과도한 희석을 방지하기 위해 너무 많지는 않음). 예를 들어, 4 x 100 μL = 400 μL 대신 450 μL를 사용하여 12웰 플레이트의 4웰에서 트랜스펙션합니다.
- mRNA transfection 시약의 필요한 부피를 계산합니다. mRNA transfection 시약은 1:50의 비율로 첨가됩니다. 예를 들어, 450 μL의 최종 부피를 위해 9 μL의 mRNA transfection 시약이 필요합니다.
- 필요한 mRNA의 총량을 계산합니다. 효율적인 transfection을 위해서는 100,000개의 대식세포당 최소 100ng이 필요하며, 200ng이 더 효과적입니다(예: 400,000개의 대식세포를 transfection하는 데 800ng mRNA).
- 필요한 mRNA의 계산된 양에 transfection해야 하는 well의 총 수를 곱합니다(예: 각각 400,000개의 대식세포가 있는 4개의 well: 모든 well에 대해 총 4 x 800ng = 3,200ng mRNA가 필요함). 예를 들어, mRNA 스톡이 426.8 ng/μL인 경우, 각각 400,000개의 대식세포가 있는 4개의 웰을 최적으로 transfection하려면 7.49 μL가 필요합니다.
- 계산된 mRNA transfection buffer 부피(단계 5.1)에서 mRNA transfection 시약의 부피(단계 5.2) 및 mRNA 부피(단계 5.3)를 뺀 값을 반응 튜브에 추가합니다. 예를 들어, 450 μL - 9 μL - 7.49 μL = 433.51 μL입니다.
- mRNA 스톡을 해동하고 용출 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 계산된 mRNA 부피(5.3단계)를 mRNA 반응 완충액이 있는 반응 튜브에 추가합니다(위에 제시된 예: 433.51μL에서 7.49μL).
- 2,000 x g에서 5초 동안 소용돌이치고 2초 동안 스핀 다운합니다.
- mRNA transfection 시약을 5초 동안 볼텍스하고 2,000 x g에서 2초 동안 스핀 다운합니다.
- 계산된 부피의 mRNA transfection 시약(단계 5.2)을 mRNA transfection buffer와 mRNA가 포함된 반응 튜브에 추가합니다(위에 제시된 예: 9μL의 mRNA transfection 시약).
- 5초 동안 트랜스펙션 믹스를 소용돌이치고 2,000 x g에서 2초 동안 스핀 다운합니다.
- RT에서 15분 동안 배양합니다.
- 한편, 대식세포의 배양 배지를 신선하고 따뜻한 배양 배지로 교체합니다(단계 4.2.18. 및 4.4.5 참조).
- 배양 단계 5.10 후, 웰의 크기에 적합한 부피로 대식세포가 포함된 웰에 형질주입 혼합물을 추가합니다(단계 5.1 참조). transfection mix를 웰 바깥쪽에서 중앙까지 원을 그리며 적가합니다.
- 플레이트를 처음에는 수직으로, 그 다음에는 수평 방향으로 부드럽게 흔들어 웰에서 transfection mix가 균일하게 분포되도록 합니다. 그런 다음 37 ° C 및 5 % CO2에서 배양합니다. transfection된 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 합성은 transfection 직후에 시작됩니다. 최상의 결과를 얻으려면 최소 6시간 동안 배양하십시오.
- 배양 후 (면역)형광 현미경 검사, 유세포 분석 또는 면역 블롯을 통해 transfection 효율을 분석하거나 선택한 실험에 transfection된 대식세포를 사용합니다.