혼합 3D 배양에서 표적 세포 제거를 위한 근적외선 광면역요법

초록

출처: Sato, K. et al., 근적외선 광면역요법 기법을 사용한 혼합 3D 배양에서 선택적 세포 제거.J. Vis. 특급 (2016)

이 동영상은 근적외선 광면역요법을 통해 혼합 3D 세포 배양에서 특정 세포를 선택적으로 제거하는 기술을 보여줍니다. 이 방법에서는 NIR 광흡수제와 접합된 항체를 사용하여 표적 세포를 정확하게 식별합니다. 이후 적외선을 조사하면 세포 사멸을 유도하여 3D 배양에서 표적 세포를 효과적으로 제거할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 다음 프로토콜은 근적외선 광면역요법(NIR-PIT)을 사용하여 특정 세포를 제거하는 데 필요한 단계를 설명합니다. NIR-PIT 및 세포 생존율에 대한 대조군 및 기타 세부 정보는 다른 곳에서 확인할 수 있습니다.

1. 적외선 700 (IR700)과 단클론 항체 (mAb)의 접합

1. 0.1M 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄)(pH 8.6) 용액에서 2-5mg/ml의 관심 mAb를 준비합니다.
2. 마이크로 원심분리기 튜브에서 0.1M Na₂HPO₄ 용액(pH 8.6)에 6.8 nmol의 mAb와 30.8 mM IR700을 혼합하고 알루미늄 호일로 덮은 상태에서 1시간 동안 실온에서 배양합니다.
3. PD-10 컬럼(재료/장비 표 참조)을 15ml PBS로 두 번 세척합니다. 1.2단계에서 샘플을 로드합니다.
4. 제조업체의 지침에 따라 PBS 용출로 PD-10 컬럼을 통해 혼합물을 정제합니다.
   참고: 여기서 용리는 IR700의 밴드 색상을 따라 이루어졌습니다. 300μl 샘플의 경우 PBS 용출 분획은 일반적으로 2.5ml에서 4.4ml 사이입니다.
5. 분광 광도계로 595nm에서 흡수를 측정하여 Coomassie 염색으로 단백질 농도를 측정합니다. 689nm에서 흡수된 IR700의 농도를 측정하여 각 mAb 분자에 접합된 형광단 분자의 수를 확인합니다.
   참고: 분광 광도계를 사용하여 1mAb 내 IR700 분자의 최적 접합 수를 결정하는 것이 중요합니다. 일반적으로 1mAb 분자에 약 3개의 IR700 분자가 있는 것이 in vitro 및 in vivo 작업 모두에 최적입니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 도데실-황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 방법을 사용하여 mAb 및 IR700의 결합 여부를 확인할 수 있습니다.
6. 단백질 농도를 결정한 후 4 °C에서 보관하십시오.

2. 혼합 3D 세포 배양(혼합 스페로이드)의 준비

1. 멸균수(약 1ml)를 매달린 드롭 플레이트의 플레이트 저장 장치 부분에 적용합니다.
2. A431-luciferase-green 형광 단백질(A431-luc-GFP) 세포 및 3T3-적색 형광 단백질(3T3-RFP) 세포와 같은 관심 세포 유형의 다양한 비율을 준비하며, 각 샘플에는 50μl의 배양 배지에 부유하는 총 5,000개의 세포가 포함되어 있습니다.
   참고: 세포 유형에 따라 배양 배지에서 관심 세포 유형의 1:100, 10:100, 25:100, 50:100 등의 비율을 준비합니다.
3. 37 ° C와 5 % 이산화탄소의 가습 인큐베이터에서 96 웰 행잉 드롭 플레이트에서 5-7 일 동안 혼합물을 배양합니다. 2일마다 배양 배지를 교체하십시오. 참고: 3D 스페로이드를 정밀하게 만들려면 세포를 포함하는 방울이 3D 모양을 형성하기 전에 쉽게 떨어지므로 플레이트를 부드럽게 다루십시오.
4. 10X - 40X 배율에서 도립 명시야 현미경을 사용하여 스페로이드의 형태와 크기를 관찰합니다. 참고: 세포 유형과 행잉 드롭의 크기에 따라 다르지만 96 웰 행잉 드롭 플레이트에서 7일 동안 배양한 후 스페로이드의 직경이 약 400-600μm인지 확인하십시오.

3. 혼합 3D 세포 배양을 위한 In vitro NIR-PIT

1. 행잉 드롭 플레이트의 배지를 10μg/ml 항체-광흡수체 접합체(APC) 함유 배지로 변경하고 37°C 및 5% 이산화탄소의 가습 인큐베이터에서 6시간 동안 배양합니다.
2. 6시간 배양 후 스페로이드를 신선한 배양 배지(페놀 레드 프리)로 두 번 세척합니다. 팁이 잘린 멸균 200μl 피펫 팁을 사용하여 100μl의 신선한 페놀 레드 유리 배양 배지가 있는 유리 바닥의 50mm 접시에 스페로이드를 부드럽게 옮깁니다. 각 접시에 하나의 스페로이드를 놓습니다.
3. 거꾸로 된 명시야 현미경으로 스페로이드를 관찰하여 형태의 변화를 감지합니다. 광학 리포터(예: GFP 및 RFP)를 관찰하려면 다음 필터 설정과 함께 형광 현미경을 사용하십시오: GFP — 469nm 여기 필터 및 525nm 방출 필터; RFP — 559nm 여기 필터 및 630nm 방출 필터.
4. 방사선 조사를 위해 바닥이 유리로 된 접시 위에 발광 다이오드(LED)를 놓습니다.
   참고: 스페로이드는 현미경 또는 층류 후드에서 NIR 광에 노출될 수 있습니다.
   1. 광학 파워 미터로 NIR-light의 출력 밀도를 측정합니다. 이 측정에 따라 2 J/cm².
      에서 670 - 710 nm의 파장에서 빛을 방출하는 발광 다이오드(LED)를 통해 NIR 광을 조사합니다 알림: LED 조명은 약 5인치의 최대 깊이를 관통할 수 있습니다. NIR-PIT의 세포독성 효과는 전력 밀도 및 노출 기간에 관계없이 주어진 에너지에만 의존합니다.
5. 방사선 조사 후 스페로이드를 50μl의 신선한 배양 배지가 있는 새로운 매달링 드롭 플레이트에 옮기고 37°C와 5% 이산화탄소의 가습 인큐베이터에서 1일 동안 배양합니다.
팁이 절단된 멸
6. 균 200μl 피펫 팁을 사용하여 100μl의 신선한 배양 배지(페놀 레드 없음)가 있는 유리 바닥 접시에 스페로이드를 부드럽게 옮깁니다.NIR-PIT 1일 후 3.3단계에 설명된 필터 설정을 사용하여 형광 현미경으로 스페로이드를 관찰합니다.
   1. 최종 농도 2 μg/ml에서 배지에 프로피듐 요오드화물을 첨가하거나 형광 현미경을 사용하여 세포질 GFP 형광을 손실하여 죽은 세포를 검출합니다(그림 1B).
7. 대상 셀이 완전히 제거되지 않은 경우 3.1-3.6단계를 반복합니다.

결과

그림 1. 3D 세포 스페로이드(A431-luc-GFP 및 3T3-RFP 세포의 혼합 스페로이드)에서 표적 세포 제거.(A) NIR-PIT(2 J/^cm2) 요법이 표시됩니다. (B) 반복된 NIR-PIT는 혼합 3D 스페로이드에서 비표적 세포(3T3-RFP)에 해를 끼치지 않고 표적 세포(A431-luc-GFP)를 완전히 제거했습니다. Bar = 200μm. (C) 루시페라아제 활성(RLU 비율)의 정량화는 표적 세포(n = 각 그룹에서 10개의 스페로이드)를 완전히 제거하는 것으로 나타났습니다. 데이터는 s.e.m± 수단으로 표현됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
IRDye 700DX 에스테르 적외선 염료	LI-COR Bioscience (미국 네브래스카주 링컨)	929-70011
나2HPO4	SIGMA-ALDRICH (미국 미주리주 세인트루이스)	S9763
Sephadex G25 컬럼(PD-10)	GE Healthcare(미국 뉴저지주 피스카타웨이)	Tel.: 17-0851-01
Coomassie(브래드포드) 플러스 단백질 분석	Thermo Fisher Scientific Inc(미국 매사추세츠주 월섬)	파이-23200
Perfecta3D 96-웰 행잉 드롭 플레이트	3D Biomatrix Inc (미국 미시건주 앤아버)	HDP1096-8
광 파워 미터	Thorlabs (미국 뉴저지주 뉴턴)	미세먼지100
주도의: L690-66-60	Marubeni America Co. (미국 캘리포니아주 산타클라라)	L690-66-60
벡티빅스(파니투무맙)	Amgen (미국 캘리포니아주 사우전드 오크스)
35mm 유리 바닥 접시, 접시 크기 35mm, 우물 크기 10mm	Cellvis (미국 캘리포니아주 마운틴뷰)	D35-10-0-N