제대혈 조혈 줄기세포를 분리하여 인간 면역계 마우스를 생성하다

초록

출처: Lanis, JM, et al. 인간 종양을 지닌 인간화 마우스 모델에서 암 면역 치료제 테스트. J. Vis. 특급 (2022)

이 비디오는 인간 면역 체계(HIS) 마우스를 생성하는 기술을 보여줍니다. CD34⁺ 조혈모세포(HSC)는 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 인간 제대혈 버피 코트 세포에서 분리됩니다. CD34⁺ HSC는 사이토카인이 풍부하고 동결 보존된 성장 배지에서 확장됩니다. 마지막으로, 해동된 HSC를 면역결핍 새끼 마우스에 주입하여 HIS 마우스 모델을 확립합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. HIS 마우스의 세대

1. BALB/c -Rag2^null Il2RγC^null Sirpα^NOD (BRGS) 마우스의 마우스 축산
   메모: 이 균주는 T, B 또는 자연살해(NK) 세포가 없는 극도로 면역 결핍입니다. 따라서 기회 감염을 방지하기 위해 엄격한 조치를 취해야 합니다. 트리메토프림(trimethoprim)과 설파디아진(sulfadiazine)이 함유된 식단을 2주 일정으로 일반 식단과 번갈아 가며 식단을 유지합니다. 가능한 최고 수준의 예방 조치 하우징 룸(예: 접근이 제한된 배리어 샤워실)을 유지하십시오.
   1. BALB/c, -Rag2,^null, Il2RγC^{, null}, Sirpα^NOD (BRGS) 및 BALB/c, Rag2,^null, Il2RγC^{, null}, Sirpa^Balb/c (BRG) 동형접합 마우스의 군체를 육종자로 유지합니다.
   2. BRGS^N/N×BRG^B/B를 교배하여 BRGS^B/N 새끼를 생성하고, 이는 인간 줄기 세포의 수용자로 사용됩니다. 이 군체에서 BRGS^B/N은 BRGS^N/N보다 건강하고 동등한 수준(BRG보다 많음)으로 생착합니다.
2. 탯줄 혈액(CB)에서 CD34+ 인간 줄기 세포 분리
   메모: 이 절차에는 항생제가 사용되지 않습니다. 따라서 우수한 멸균 기술이 필수적입니다.
   1. 멸균된 생물 안전 작업대(BSC)에 50mL 코니컬 튜브 랙과 3x 15mL 및 ~10x 50mL 코니컬 튜브를 놓습니다. 채혈 백에 70% 에탄올을 뿌리고 BSC에서 건조시킵니다.
   2. CB 밀도 구배 분리 = CB 부피/15에 필요한 50mL 코니컬 튜브의 수를 반올림하여 짝수 튜브 수로 계산합니다. 튜브당 혈액량 = CB 부피/튜브 수를 계산합니다. CB 백에서 각 원추형 튜브로 조심스럽게 혈액을 붓습니다. 튜브당 최대 15mL입니다. 자동 피펫터와 25mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 혈액을 멸균 PBS와 1:1로 혼합합니다.
   3. 저속의 자동 피펫터와 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 계면을 방해하지 않고 실온(RT) 1.077g/mL 밀도 구배 용액(재료 표 참조)으로 혈액 밑에 천천히 깔아줍니다. 피펫 팁이 튜브 바닥에 닿지 않도록 하십시오. 모든 튜브에 대해 반복합니다. 그런 다음 RT에서 제동 없이 850 x g에서 30분 동안 원심분리하여 밀도 구배를 유지합니다.
   4. 1.077g/mL 밀도 구배 위에 있는 세포 버피 코트를 흐린 흰색 층으로 시각화합니다. 25 mL 혈청학적 피펫과 자동 피펫터를 사용하여 혈장층을 제거하고 버피 코트 위 약 10 mL까지 폐기합니다.
   5. 멸균 전사 또는 혈청학적 피펫으로 버피 코트를 수집합니다. 피펫을 주걱처럼 사용하여 원뿔형 튜브 측면에서 세포를 긁어내면서 전구를 방출(또는 천천히 피펫팅)하여 세포를 끌어올립니다. 두 개의 50 mL 코니컬 튜브의 버피 코트를 하나의 새로운 50 mL 코니컬 튜브로 결합합니다.
   6. 각 원뿔형 튜브에 45% 소 태아 혈청(FBS)이 함유된 멸균 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS) 2mL를 부어 세포를 세척합니다. 상온에서 360 x g에서 11분 동안 원심분리기
   .
   7. 세척 매체를 모든 튜브의 펠릿까지 흡입합니다. 10mL 혈청학 피펫과 자동 피펫터를 사용하여 2% FBS가 함유된 10mL의 HBSS에 첫 번째 펠릿을 재현탁합니다. 각 펠릿을 동일한 10mL의 HBSS에 재현탁하고 각 튜브를 10mL의 HBSS로 추가로 헹구어 모든 세포를 단일 튜브에 모읍니다.
   8. 원뿔형 튜브에 2% FBS가 함유된 멸균 HBSS 45mL를 붓습니다. 4°C에서 360 x g에서 10분 동안 원심분리기.
   9. 세척 버퍼를 세포 펠릿까지 흡입하고 펠릿을 20mL의 자기 세포 분리기 완충액에 재현탁합니다(재료 표 참조). 작은 부분 표본을 제거하여 메틸렌 블루로 1:20 희석한 혈구계로 세포를 계수합니다. 파란색과 흰색 셀의 수를 추가합니다. 360 x g에서 원심분리기, 4°C에서 10분 동안
      메모: 이 프로토콜은 마그네틱 비드 기술을 사용합니다(재료 표 참조). 이 프로토콜은 CD34+ 줄기 세포의 충분한 순도와 수율로 모든 세포 분리 기술과 함께 사용할 수 있도록 수정할 수 있습니다.
   10. 상층액을 흡인하고 제대혈에서 분리된 CD34+ 세포 펠렛을 1 x 10⁸ 세포당 300μL의 자기 세포 분리기 완충액에 재현탁합니다. 100μL의 Fc 수용체(FcR) 차단 시약을 먼저 추가한 다음 1 x 10⁸ 세포당 100μL의 CD34+ 마그네틱 비드를 추가합니다. 4 ° C에서 30 분 동안 배양합니다 (얼음 없음).
   11. 1 x 10⁸ 셀당 5mL의 자기 세포 분리기 버퍼를 추가하고 4 °C에서 10분 동안 360 x g에서 회전합니다. 세척 단계를 반복하고 "unfractionated"라고 표시된 15mL 원뿔형 튜브의 1 x 10⁸ 세포당 500μL의 자기 세포 분리기 버퍼에 펠렛을 재현탁합니다.
   12. 두 개의 15mL 코니컬 튜브 "CD34-" 및 "CD34+"에 라벨을 붙입니다. 3개의 15mL 코니컬 튜브(비분획, CD34- 및 CD34+)를 냉각 랙의 슬롯 A1, B1 및 C1에 각각 놓습니다(재료 표 참조). 제조업체의 기기 지침에 따라 BSC의 자동 자기 셀 분리기(재료 표 참조)에서 2열 포지티브 선택 프로그램을 사용하여 셀을 분리합니다.
3. CD34+ 인간 줄기 세포의 확장 및 동결
   1. 회수된 CD34+ 세포 현탁액(2mL)의 10μL를 혈구계 슬라이드에 분취하고 10배 배율로 세포를 계수합니다. CD34+ 셀의 총 수를 셀 수에 2 x 10⁴를 곱하여 계산합니다. 총 CD34+ 세포 수를 250,000으로 나누어 동결할 바이알의 수를 계산합니다(체외 확장 전 새끼 쥐당 50,000개).
   2. 40ng/mL 줄기세포 인자, 20ng/mL FMS 유사 티로신 키나아제 3 리간드(Flt3L) 및 10ng/mL 인터루킨-6(IL-6)을 보충한 CB 배지 Iscove의 10% 태아 송아지 혈청(FCS)(필터링 손실을 위해 추가 1mL 추가)을 준비하고 0.22μm 필터를 통과시킵니다. CD34+ 세포를 CB 배지 mL당 100,000으로 재현탁하고 37°C에서 배양합니다. 3일차에 사이토카인이 없는 CB 배지를 세포가 들어 있는 플라스크와 사이토카인이 있는 CB 배지에 등가량의 추가합니다.
      메모: 이러한 사이토카인을 CB 배지에 첨가하면 CD34+ 세포의 생존과 증식을 촉진하는 동시에 분화를 방지할
   수 있습니다.
   3. 5일째에 팽창된 CD34+ 세포를 수확합니다. 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하고 50mL 코니컬 튜브에 수집합니다. 플라스크 바닥을 덮을 만큼 충분한 CB 배지를 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크 바닥 전체를 긁어냅니다. 모든 배지를 동일한 50mL 튜브에 모으고 360 x g에서 11분 동안 원심분리합니다.
   4. 2mL의 CB 배지에 세포를 재현탁합니다. 피펫의 최종 한 방울을 계수하기 위해 96웰 플레이트에 저장합니다. 세포를 트리판 블루로 1:1로 희석하고 혈구계에 10μL를 추가한 다음 4개의 사분면에서 세포를 계수하고 평균을 계산합니다. 세포 수에 4 x 10⁴를 곱하여 CD34+ 세포의 총 수를 계산하고 생존 가능성을 기록합니다.
   5. n+1mL의 동결 매체를 만들며, 여기서 n은 1.3.1단계에서 계산된 동결 바이알의 수입니다. FBS에 10%(v/v) 디메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 동결 매체를 준비하고 얼음에 보관합니다. cryovials에 CB#, CD34+ d5 및 date를 표시합니다.
   6. CD34+ 세포를 360 x g에서 4°C에서 10분 동안 스핀다운합니다.배지를 펠릿까지 흡입하고 세포 펠릿을 동결 배지에 재현탁합니다. 각 바이알에 1mL의 세포 현탁액을 분취하고 나머지를 바이알 사이에 균등하게 나눕니다. 바이알을 4°C로 냉각한 이소프로판올 셀 냉동고에 넣고 -80°C에 놓고 액체 질소로 옮겨 >90일 동안 보관합니다.
4. 새끼 쥐의 방사선 조사
   1. 출생 후 1-3일 후에 BRGS^B/N 새끼를 패딩이 있는 오토클레이브 플라스틱 상자에 모읍니다. 강아지와 함께 소량의 침구를 추가하십시오. 상자에 케이지 번호와 새끼 수를 표시하십시오.
   2. 조사기(재료 표 참조)를 300 rad의 용량으로 설정합니다.강아지 상자를 조사기에 넣고 300 rad에 노출시킵니다. 새끼를 우리로 다시 데려가 더미에 넣고 침구로 덮습니다.
5. 강아지 주사 및 CD34+ 세포 준비
   1. 방사선 조사 후 ~3시간 후에 CD34+ 세포 준비를 시작합니다. 50mL 원뿔형 튜브에 10mL의 CB 배지를 넣고 가열합니다. 멸균 BSC에서 모든 단계를 수행합니다.
   2. 주입할 새끼 4-6명당 체외 확장 및 동결 CD34+ 세포 1바이알을 회수합니다. 55°C에서 소량의 얼음만 보일 때까지 급속 해동한 다음 가열된 CB 배지에 세포를 추가합니다(바이알은 만졌을 때 여전히 차가워야 함). 배지 1mL를 사용하여 각 바이알을 헹구고 4°C에서 12분 동안 360 x g에서 셀을 회전시킵니다.
      참고: 55°C에서 급속 해동은 37°C에서 해동하는 것보다 더 나은 세포 생존율(90%-95%)을 생성하는 것으로 밝혀졌습니다.
   3. 매체를 조심스럽게 흡입하십시오. (작은) 펠릿을 CB 배지 2mL에 재현탁시키고, 부드럽게 혼합한 후 세포 현탁액 ~30μL를 계수 플레이트의 단일 웰에 추가합니다. 트리판 블루로 1:1로 희석한 다음 혈구계에 10μL를 추가하고 4개의 사분면에서 세포를 계수하고 평균을 냅니다.
   4. 세포 수에 4 x 10⁴를 곱하여 CD34+ 세포의 총 수를 계산한 다음 생존 가능성을 기록합니다. 360 x g에서 4°C에서 12분 동안 회전합니다.
   5. 배지를 조심스럽게 흡인하고 주입할 n+1 새끼당 100μL의 멸균 PBS에 세포 펠릿을 재현탁하여 마우스당 250,000-450,000 CD34+ 세포를 생성합니다. 원뿔형 튜브를 운송 용기의 얼음 위에 놓고 강아지 주사를 위해 사육장으로 이동합니다.
   6. 열 램프, 기저귀, 1mL 주사기, 18G 바늘, 30G 바늘 및 멸균 용기에 담긴 CD34+ 세포 준비물을 Vivarium BSC로 가져옵니다. 열 램프 아래에 멸균 기저귀 ~2피트를 놓습니다. 주입할 깔짚이 있는 케이지를 회수하여 BSC에 넣습니다.
   7. 18G의 베벨 바늘로 주사기를 조립합니다. 원뿔형 튜브의 각도를 바늘의 베벨과 일치시키고 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 끌어 올립니다. 강아지를 기저귀에 올려 따뜻하게 합니다(과열에 주의). 주사기에서 공기를 제거하고 18G 바늘을 30G 바늘로 교체한 다음 세포 현탁액이 바늘 끝에 올 때까지 주사기를 조심스럽게 밀어 넣습니다.
      메모: 대안적으로, 인슐린 주사기를 사용할 수 있습니다.
   8. 한 번에 한 마리의 강아지를 열 램프에서 떨어진 기저귀 가장자리로 데려갑니다. 엄지와 검지 아래에 강아지를 옆으로 눕히지 않도록 하여 얼굴을 선명하게 볼 수 있도록 합니다. 귀가 있을 곳 아래의 뺨을 가로지르는 정맥을 주목하십시오. 눈에서 가장 가까운 정맥(IV)에 바늘을 얕게 삽입하고 50μL의 세포를 천천히 주입합니다.
   9. 피하 주사로 기포가 형성되고 있는지 확인합니다. 그렇다면 바늘을 더 깊게 삽입하고 세포 주입을 진행하십시오. 성공하면 작은 혈액/혈종 한 방울이 보일 것입니다.
   10. 강아지가 여전히 움직이지 않은 상태에서 다른 50μL의 세포(IV+IH의 강아지당 총 100μL)로 간내 주사(IH)를 수행합니다. 간은 백색 우유 띠와 흉곽 사이의 어두운 점으로 시각화할 수 있습니다. 주사를 맞은 강아지를 주사하지 않은 강아지로부터 더 멀리 떨어진 기저귀에 올려놓고 가열합니다.
       메모: IV 주사는 IH 주사만 사용하는 것보다 장기적으로 더 나은 키메라를 일으키지만, IV 주사가 항상 성공적인 것은 아닙니다. 그러므로, IV와 IH 사이에 주사를 분할하면 더 많은 비율의 마우스에 생착을 보장할 수 있습니다.
   11. 모든 강아지에 대해 안면 정맥과 IH 주사를 모두 반복합니다. 피를 닦아내고, 새끼를 새장에 있는 둥지로 돌려보내고, 침구로 덮는다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1mL 주사기(바늘 포함)	맥케슨	1031815
15 mL 튜브	그르니에 바이오 원	188271
2-메르캅토에탄올	시그마	M6250
50 mL 튜브	그르니에 바이오 원	227261
AutoMACS Pro 분리기	밀테니	Tel.: 130-092-545
증권 시세	피셔 사이언티픽	BP1600100
칠 15 랙	밀테니	Tel.: 130-092-952
배아 줄기세포 FCS	지브코	10439001
Eppendorf Tubes; 1.5 mL 용량	그르니에 바이오 원	616201
뛰어나다	마이크로소프트
FBS(증권 시세	벤치 마크	100-106 500ml
피콜 히파크	GE 헬스케어	45001752
유리 피펫	DWK 생명과학	재질 보기 63A53
HBSS w/ Ca & Mg	시그마	55037씨
멀티라드 350	정밀 X-Ray
PBS (PBS)	코 닝	45000-446
프리즘	그래프패드
렉 후 FLT3L	R&D 시스템	308-FK-005/CF
렉 후 IL6	R&D 시스템	206-IL-010/CF
렉 후 SCF	R&D 시스템	255SC010
혈청학적 피펫 25 mL	피셔 사이언티픽	1367811
멸균 필터	날진	567-0020
멸균 분자수	시그마	7732-18-5
예티 세포 분석기	바이오 라드	12004279

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