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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 세포 접종
- 세포 및 동물의 준비
- 세포주가 권장 배지에서 유지되는지 확인합니다. 예를 들어, 2mM L-글루타민, 10% 소 태아 혈청, 20mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 0.05mM 2-메르캅토에탄올, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신.
이 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지에서 WEHI 164 세포주를 유지합니다.
메모: 계대 세포는 최소 3회에서 최대 5회 극저온 저장에서 제거된 후 추출합니다. 최적의 세포 생존력을 보장하려면 세포가 70-80% 융합될 때 세포를 분할해야 합니다. 종양 세포주에 대한 마이코플라스마 검사는 감염이 세포 성장을 변화시키고 생체 내 면역 반응에 영향을 미칠 수 있으므로 반드시 검사해야 합니다.
- 접종 하루 전, 클리퍼를 사용하여 오른쪽 아래 옆구리의 마우스를 면도합니다.
메모: 이 실험에는 정상 체중(16-22g)인 8-12주 사이의 암컷 BALB/c 마우스가 사용되었습니다.
- 접종 당일, 트립신화에 의해 70-80%가 합류할 때 WEHI 164 세포를 수확합니다.
- 조직 배양 플라스크에서 배양 배지를 흡입한 다음 멸균 인산염 완충 용액(1x PBS)을 첨가하여 남아 있는 소 태아 혈청(FBS)을 제거합니다.
- 조직 배양 플라스크에서 PBS를 흡인합니다. 0.05% 트립신 3mL(T75 플라스크의 경우)를 추가한 다음 세포가 있는 플라스크의 전체 표면이 트립신으로 덮이도록 플라스크를 휘젓습니다.
- 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 3분 동안 플라스크를 배양하고 플라스크의 측면을 두드려 세포가 이탈되었는지 확인하여 주기적으로 세포를 확인합니다.
- 세포 배양 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 FBS가 보충된 배지 5mL를 추가하여 트립신을 중화합니다.
메모: 트립신에 세포를 필요 이상으로 오래 방치하면 세포가 손상되고 세포 생존율이 낮아질 수 있으므로 세포를 트립신에 더 오래 두지 마십시오.
- 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 피펫 현탁액을 여러 번 사용합니다. 세포 현탁액을 원뿔형 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 350 x g에서 3분 동안 회전하여 펠릿 세포를 만듭니다.
- 1x PBS에서 세포를 세 번 세척합니다.
- 50mL의 멸균 1x PBS에 세포를 재현탁시키고 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 세포를 세척합니다. 350 x g에서 3분 동안 회전하여 펠릿 세포를 만듭니다.
- 상층액을 흡인하고 15mL의 멸균 1x PBS에서 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 세포를 세척합니다. 350 x g에서 3분 동안 회전하여 펠릿 세포를 만듭니다.
- 상층액을 흡인하고 정확히 10mL의 멸균 1x PBS에서 세포를 재현탁합니다. 1.1.4.2단계에서와 같이 세포를 세척하고 소량(약 100μL)의 세포 현탁액을 계수를 위해 원심분리 튜브로 옮깁니다. 350 x g에서 3분 동안 회전하여 펠릿 세포를 만듭니다.
- 혈구계(hemocymeter) 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 Trypan blue exclusion 방법을 사용하여 세포 수를 결정합니다. 멸균 1x PBS에서 5 x 106 cells/mL의 농도로 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오.
메모: 종양 세포의 생존율은 재현 가능한 종양 성장을 보장하기 위해 80% 이상이어야 합니다.
- 피하접종
- 세포 현탁액을 철저히 혼합하고 멸균 1x PBS에 100μL의 세포 현탁액(5 x 10,5개 셀)이 있는 26G 바늘로 주사기를 채웁니다. 다음 주사기를 로드하기 전에 세포 혼합을 반복합니다.
메모: 생존력을 유지하기 위해 시술 내내 세포를 얼음 위에 두십시오.
- 마우스를 적절하게 제지하여 오른쪽 아래 측면에 접근할 수 있도록 합니다. 면도한 오른쪽 아래 측면에 마우스를 피하로 접종합니다.
메모: 피부 아래에서 볼 수 있는 바늘을 약간 들어 올려 접종이 복막에 있지 않은지 확인합니다. 접종 후 피부 아래에 거품 같은 덩어리가 형성되어야 합니다.
- 해당 윤리 승인에 따라 마우스를 모니터링하고 종양이 약 50mm2의 크기로 자랐을 때 외과적 절제를 수행합니다.
2. 종양의 부분적 외과적 절제
참고: 이 프로토콜은 두 명의 연구원을 필요로 합니다; 하나는 수술 절차(SURGEON)를 위한 것이고, 다른 하나는 마우스 모니터링(ASSISTANT)을 위한 것입니다.
- 수술 설정
- 접종 후 12일째, 종양이 약50mm2의 크기에 도달한 경우, 수술 30분 전에 목덜미에 100μL(0.1mg/kg)의 부프레노르핀 s.c.를 마우스에 투여합니다.
- 벤치 코트로 덮인 열 패드로 수술 부위를 설정하고 마취를 위해 노즈콘을 설정합니다. 사용하기 전에, 그리고 열 비드 살균기를 사용하여 각 동물 사이에 수술 도구를 소독하여 사용하기 전에 도구를 식히십시오.클로르헥시딘, 면봉, 거즈, 아이 젤, 곡선 겸자 2개, 가위, 클립 어플리케이터, 클립 제거제 및 클립 리필과 같은 수술 장비를 청소하고 손이 닿기 쉬운 곳에 두십시오(그림 1A, 1B).
- 가열실을 37°C로 예열하고 복구를 위해 다른 열 패드를 설정합니다(그림 1C).멸균된 도구를 오토클레이브 패드와 같은 멸균 표면에 놓습니다.
- 마취
- 마우스를 유도실에 넣고 호흡 속도가 분당 약 60회(초당 1회)로 느려질 때까지 4% 이소플루란(1L/분의 유속으로 100% 산소에 4%)으로 마우스를 마취합니다(보통 <1분 소요).
메모: 질식 및 사망으로 이어질 수 있으므로 마우스를 챔버에 너무 오래 두지 마십시오. 한 번에 한 마리의 마우스만 마취 상태로 두십시오.
- 수술대의 열 패드에 마우스를 옮기고, 코가 있는 마우스를 콧방울에 넣고, 0.5L/min의 유속으로 100% 산소에 3-4% 이소플루란으로 마취 상태를 유지합니다. 호흡 속도를 모니터링하여 마취 깊이가 유지되는지 확인합니다.
메모: ASSISTANT는 올바른 수준의 마취가 유지되는지 확인하기 위해 수술 내내 마우스의 호흡을 모니터링해야 합니다. 호흡이 너무 느려지면 마취 농도를 낮추고, 마취 깊이가 너무 얕으면 농도를 높이십시오. 마우스가 헐떡이기 시작하면 콧방울에서 마우스를 제거하고 마취 농도를 낮추고 호흡이 정상화될 때까지 기다렸다가 콧방울에 다시 놓습니다.
- "핀치 테스트" 및 "각막 반사 테스트"를 수행하여 수술을 시작하기 전에 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다.
메모: 마우스의 일부가 움직이면 마우스가 완전히 마취되지 않았다는 표시입니다. 동물은 즉시 마취제 농도를 증가시켜 추가 마취제를 투여해야 합니다.
- 안구 건조를 방지하기 위해 소량의 안과 젤로 마우스의 눈을 덮으십시오.
- 수술
- 알코올성 클로르헥시딘으로 수술 부위를 3회 면봉으로 닦습니다. 집게와 가위를 사용하여 종양에서 3mm 떨어진 등쪽을 따라 1cm 직선으로 절개합니다(그림 2A, 2B).
메모: 모든 마우스에서 절개 부위를 1cm로 표준화하면(자 사용) 마우스 간의 상처 치유를 균일하게 평가할 수 있습니다. 절개 부위를 종양에서 3mm 떨어진 곳에 배치하면 상처에서 누출되지 않고 후속 종양 내 보조 요법이 가능합니다.
- 핀셋을 사용하여 종양과 복막 사이의 근막과 피하 지방 조직을 제거합니다. 피하 종양은 일반적으로 피부 쪽에 부착되어 있습니다.
- 핀셋을 사용하여 종양이 있는 쪽의 피부를 부드럽게 잡고 상처를 열고 종양이 밖에서 보이도록 "반전"합니다(그림 2C, 2D).
메모: 용적을 제거할 종양 부위는 상처를 봉합할 수 있을 만큼 충분한 피부를 가질 수 있도록 개구부에 가장 가까워야 합니다. 종양을 제거할 때 피부를 베지 않도록 주의합니다.
- 가위를 사용하여 종양 캡슐을 반으로 잘라 개구부에서 가장 가까운 종양 바닥부터 제거합니다.
- 50% 벌크 제거 수술의 경우 종양 중앙을 가로질러 자릅니다. 구부러진 집게를 사용하여 제거할 종양 부분을 퍼냅니다(50%). 부피가 축소된 영역에서 남은 것을 퍼냅니다.
- 75% 부피 제거의 경우 위의 2.3.5부에서와 같이 50% 종양 부피 축소를 수행합니다. 그런 다음 종양의 나머지 50%를 반으로 자르고 위에서 설명한 대로 구부러진 집게를 사용하여 종양의 25%를 퍼냅니다.
- 수술 부위 폐쇄
- 남은 종양을 피부 아래에 다시 놓고 집게를 사용하여 피부 플랩을 함께 당겨 상처를 따라 피부를 정렬합니다.
- 상처 가장자리에서 5mm 떨어진 곳에서 피부를 함께 잡고 수술 클립을 사용하여 집게에 가장 가까운 쪽부터 시작하여 상처를 봉합합니다. 밑에 있는 조직이 노출되지 않도록 필요한 만큼 클립을 적용합니다. 일반적으로 클립 사이에 2mm의 간격으로 3-4개의 클립이 적용됩니다.
메모: 잘 적용되지 않은 클립이 있으면 클립 제거제를 사용하여 제거하고 새 클립으로 교체하십시오.
- 마우스의 회복
- 쥐를 따뜻한(37°C) 가열실에 넣어 회복할 수 있도록 합니다.
- 마우스의 케이지를 열 패드에 놓습니다. 마취제에서 회복될 때까지(깨어 있고 걷기) 가열실에서 쥐를 모니터링한 다음 마우스를 케이지에 다시 넣습니다. 생쥐가 더 활성화될 때까지 10분 동안 케이지를 열 패드에 그대로 두십시오.
- 쥐에게 젖고 부드러운 음식을 줍니다. 회복을 위해 수술 1시간 후 생쥐를 모니터링하고 클립이 제자리에 남아 있는지 확인합니다.케이지가 열 패드의 절반/절반의 위치에 있는지 확인하여 동물이 없는 동안 온도를 스스로 조절할 수 있도록 합니다.
- 수술 후 6-8시간 후(하루가 끝날 때) 0.1mg/kg 부프레노르핀(목 목덜미에 100μL)을 투여합니다. 다음날 아침 일찍 생쥐를 모니터링하고 0.1mg/kg 부프레노르핀(목덜미에 100μL 피하)을 다시 투여합니다. 필요에 따라 습식 사료를 더 많이 주십시오.
- 다음 7일 동안 매일 마우스를 모니터링합니다. 클립은 클립 제거제를 사용하여 7일 후에 제거할 수 있습니다.
- 보조 또는 선행 치료
- 관심 있는 치료에 따라 주어진 시간에 (신)보조 요법으로 수술 전후에 마우스를 치료합니다.
- 예를 들어, 접종 후 15일째에 100μg의 항-CTLA-4를 복강내(i.p.)로 1회 투여하거나 접종 후 15일, 17일, 19일째에 200μg의 항-PD-1 i.p.를 3회 투여합니다.
