마우스 모델에서 인간 피부 이식을 위한 기술

초록

출처: Moss, M. I. et al., 생체 내에서 인간 면역 반응을 조작하기 위한 이종 이식 피부 모델.J. Vis. 특급 (2022)

이 비디오는 호중구 반응이 억제된 면역 결핍 마우스에 인간 피부를 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 인간의 분할 두께 피부를 마우스의 이식 침대에 적용하고 밀봉한 다음 복구를 위해 덮는 것입니다. 결국 인간의 피부가 쥐의 피부에 달라붙어 혈관 형성과 순환을 확립하여 성공적인 피부 이종 이식을 가능하게 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 기증자 인간 피부 샘플 처리

참고: 이 이식에 사용된 인간 피부 샘플은 건강한 환자의 복부에서 채취한 대규모 샘플이었습니다. 샘플은 15cm x 7.5cm 이상이어야 합니다. 크기 제한은 피부를 사용할 수 있는 마우스의 수와 이식편 크기 선택에 영향을 미칠 수 있습니다.

1. 준비 및 이식 전에 피부 샘플을 차가운 온도(얼음 위, 4°C)에서 유지하십시오. 인산염 완충 식염수(PBS)에 거즈를 적신 상태로 밀폐된 검체 채취 컵에 샘플을 촉촉하게 유지합니다.
   참고: 피부 샘플을 4°C에서 2일 이상 보관하는 것은 권장하지 않습니다. 그러나 스킨 샘플이 더 오래 저장되는 보고서가 있습니다.
   주의: 모든 인체 조직은 표준 생물학적 위험 예방 조치로 치료하십시오.
2. 멸균된 해부판의 멸균된 음압 조직 배양 후드에서 인간 피부 샘플을 피부종을 준비합니다.
3. 피부 샘플을 표피 면이 위로 향하게 하여 해부 보드에 놓습니다. 멸균 알코올 준비 패드로 표피를 닦은 다음 PBS로 닦습니다.
4. 1.5인치 절제 T핀으로 피부의 더 가까운 가장자리를 제자리에 고정합니다(재료 표 참조).
5. 400μm 두께의 피부 표본을 진피하고 30°-45° 각도로 앞으로 절단하면서 일정한 압력을 가합니다. 모든 기기별 지침 및 안전 조치를 따르십시오(재료 표 참조).
   참고: 진피절개 기법에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 보고서를 참조하십시오.
6. 멸균 PBS에 적신 멸균 거즈를 접시 바닥에 놓아 100mm x 20mm 페트리 접시를 준비합니다. 젖은 거즈 위에 표피 쪽이 위로 향하게 하여 피부를 놓습니다.
7. 플레이트의 가장자리를 반투명 밀봉 필름(재료 표 참조)으로 밀봉하고 덮어 샘플이 오염되지 않도록 합니다. 접목하기 전에 샘플을 4°C에서 보관하십시오.

2. 수술 전 컨디셔닝 및 준비

1. 이식을 위해 멸균 기구와 멸균 수술 스테이션을 준비합니다. 기구 및 마우스 배치를 위한 멸균 표면으로 오토클레이브 종이 타월을 사용하십시오.
   참고: 마우스는 젖을 뗀 후 이식할 수 있지만 생후 8-10주 사이에 이식하는 것이 좋습니다. 두 성별의 마우스는 접목될 수 있습니다.
2. 제모와 같은 수술 준비는 수술 부위에서 물리적으로 떨어진 곳에서 수행합니다.
3. 멸균 식염수에 1mg/mL로 희석하여 anti-GR1(재료 표 참조)을 준비합니다. 마취 유도 후 각 마우스에 100μg/100μL의 항-GR1 용액을 복강내 투
여합니다.
4. 이소플루란 또는 기타 기관에서 승인된 마취제로 한 번에 한 마리씩 쥐를 마취합니다.
   참고: 이소플루란은 유도 중 3%-5% 농도로 투여해야 합니다. 마우스가 움직이지 않으면 이소플루란 농도를 1%-3%로 낮추어 수술 기간에 영향을 줍니다.
   1. 호흡 속도, 발가락 꼬집 반응의 부재, 귀와 입의 적절한 분홍색을 관찰하여 마우스의 적절한 마취 깊이를 모니터링합니다.
      주의: 적절한 마취 기계와 제거 방법을 사용하고 이소플루란 증기에 노출되지 않도록 하십시오.
5. 마우스를 가열 패드 또는 다른 열원으로 옮깁니다(재료 표 참조).
6. 장갑을 낀 손가락으로 눈에 작은 연고 한 방울을 두드려 안과 연고를 투여합니다.
7. 진통제인 부프레노르핀(0.08mg/kg) 및 카프로펜(5mg/kg)(재료 표 참조)을 피부를 꼬집고 몸과 평행한 각도로 주사하여 피하로 투여합니다.
   참고: 기관 프로토콜에 따라 치료 전 진통제를 준비합니다. 진통제의 선택 및 투여에 대한 기관 지침을 따르십시오. 본 연구에서 사용된 진통제 방법은 2.7단계와 그림 1에 요약되어 있습니다.
8. 마우스의 꼬리를 살짝 들어 올리고 복부를 노출시킨 후 인슐린 1mL(12.7mm) 주사기를 사용하여 30° 각도로 주사하여 항-GR1(2.4단계에서 준비)을 복강내로 투여합니다.
9. 동물에게 안전한 전기 가위(재료 표 참조)를 사용하여 마우스의 등쪽 중간과 위쪽 부분을 면도합니다.
10. 모든 수염을 제거하고 면도 한 피부에 제모 연고를 넉넉히 바르고 30초에서 1분 동안
발라줍니다.
11. 제모연고를 종이 타월과 PBS로 완전히 닦아냅니다.

3. 이식 절차

1. 마우스를 제모 스테이션에서 떨어진 보조 수술 위치로 옮깁니다.
2. 요오드 면봉 스틱으로 수술 부위를 원을 그리며 가운데에서 시작하여 제모 부위의 가장자리를 향해 운동합니다.
3. 멸균 플라스틱 랩 조각을 마우스 위에 놓고 이식할 영역의 크기보다 약간 큰 플라스틱의 창을 자릅니다.
4. 메스로 이식할 기증자 피부의 직사각형 모양의 10mm x 10mm 부분을 자릅니다. 집게 뒷면으로 기증자 피부를 제자리에 단단히 잡고 메스로 집게를 옆으로 자르면 됩니다.
5. 수술용 가위를 사용하여 기증자 피부 조각의 크기와 일치하는 마우스 피부의 직사각형 영역을 잘라 이식 침대를 만듭니다. 집게를 사용하여 피부를 몸에서 당겨내고 가위로 몸에서 비스듬히 피부를 잘라 근막이 깊숙이 절개되지 않도록 합니다.
6. 기증자 피부 조각을 표피 면이 위로 향하게 하여 준비된 이식 침대에 놓습니다.
7. 겸자 뒷면을 사용하여 피부를 조작하고 기증자 피부가 이식 침대에 완전히 평평하게 놓일 때까지 앞뒤로 미끄러집니다.
8. 기증자 피부가 마우스 피부와 만나는 곳에 수술용 접착제 조직 접착제(재료 표 참조)를 한 방울 떨어뜨리고 접착제가 조직에 부착되도록 마우스와 기증자 피부를 겸자로 1-2초 동안 함께 유지합니다. 이식편의 가장자리를 완전히 밀봉하고 접착제가 완전히 마를 때까지 기다립니다.
9. 아래 단계에 따라 마우스에 붕대를 감습니다(그림 2).
   1. 이식 부위를 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분히 큰 바셀린 거즈 조각(재료 표 참조)을 자릅니다.
   2. 이식편을 바셀린 거즈로 덮고 집게를 사용하여 거즈를 피부에 가볍게 누릅니다.
   3. 너비가 마우스의 상처를 덮을 수 있을 만큼 충분히 커지도록 투명 필름 드레싱의 스트립을 세로로 자릅니다.
   4. 투명 필름 드레싱을 접착면이 아래로 향하게 하여 거즈 위에 단단히 누릅니다. 마우스를 빠르게 굴려 드레싱을 몸통에 완전히 감쌌고 호흡을 방해하지 않고 단단히 맞도록 하고 모든 팔다리가 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다.
   5. 마우스를 복구 케이지에 넣고 마우스가 깨어 움직이고 움직일 때까지 모니터링합니다. 복구 후 최소 15분 동안 케이지 일부에 열원을 제공합니다.
      참고: 동물은 회복 케이지에 넣은 후 1-5분 이내에 회복될 것으로 예상됩니다.

결과

그림 1 : 이종 이식 연구를 위해 채택된 프로토콜의 타임라인.

그림 2 : 수술 후 마우스에 붕대를 감는 방법. 마우스는 마취 상태에서 바셀린 거즈와 투명 필름 드레싱으로 단단히 감쌉니다. (A) 바셀린 거즈는 수술 상처보다 약간 큰 부위에 놓입니다. (B) 투명 필름 드레싱이 준비됩니다 : 긴 스트립이 바셀린 거즈보다 약간 넓게 절단됩니다. 투명 필름 드레싱의 접착면을 덮고 있는 뒷면이 부분적으로 제거되었습니다. (C) 필름의 접착면이 마우스 뒷면에 단단히 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10% 중성 완충 포르말린	어부	재질 보기 SF100-20	조직학을 위한 정착제
3M Vetbond 티슈 접착제	3엠	1469SB	수술용 접착제
안티 GR1 클론 RB6-8C5	바이오엑스셀	BE0075	거부 방지
오토클레이브 파우치	폭스바겐	89140-800	오토클레이브 도구 및 종이 타월용
부프레넥스 0.3mg/mL	코브트러스	59122	무 통
카프로펜 50 mg/mL	조에티스	나다 # 141-199	무 통
D42 더마톰 블레이드	휴메카	5.D42BL10	Dermatome (샘플 당 1 개의 블레이드)
진피종 D42	휴메카	4.디42	피부종
일회용 메스	바드 파커	371610	피부 준비
T-핀 해부; 1-1/2인치, 1000/CS 1.5	콜-파머	UX-10915-03	dermatome를 위한 피부 견본을 핀으로 고정하기 위하여
해부 가위	메디콘	02.04.10	시료 전처리 및 마우스 해부
DNA제	시그마-알드리치	DN25-1지	피부 소화
전기 가위	켄트	CL8787-키트	제모
집게	메디콘	07.60.07	시료 전처리 및 마우스 해부
사	피셔브랜드	제22-362-178	시료 전처리
난방 램프	모건빌 사이언티픽	HL0100	수술 후 관리
가열 패드 4" x 10"	(주)프리스텍	20415	외과용 열 공급
인슐린 1cc 12.7mm 주사기	BD (영어)	329410	약국
이소플루란	미국 약전(USP)	확인서 66794-013-25	마취
이소플루란 기계	베트핍	911103	마취
남성을 위한 나이르	나이르	10022600588556	제모
Neomycin 및 Polymyxin Bisulfates 및 Bacitracin 아연 안과 연고	데크라	재질 보기 NDC 17478-235-35	건조를 방지하는 안연고
끄덕이다. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스	잭슨 연구소	5557	마우스
종이 타월	휴지	100848	멸균 표면을 위해 고압멸균
파라필름	피셔 사이언티픽	제13-374-12	반투명 밀봉 필름
페트리 접시 150mm	코 닝	430597	시료 보관
플라스틱 랩	피셔브랜드	Tel.22-305-654	현장 준비
프로비돈-요오드 면봉 스틱	PDI	S41350	사이트 살균
소프트 피드 및 구강 수분 공급(Napa Nectar)	Se 랩 그룹 Inc	NC9066511	수술 후 회복이 잘 되지 않는 마우스를 보충하기 위해
표본 수집 컵	피셔 사이언티픽	Tel.: 22-150-266	시료 보관
멸균 알코올 준비 패드	피셔브랜드	전화: 22-363-750	피부 준비
멸균 PBS	지브코	14190-144	시료 보관용 매체
멸균 식염수	호스피라	국회도서관 0409-4888-02	약물 희석용
Tegaderm 필름 4 "x 43/4"	3엠	1626	투명 필름 상처 드레싱
바셀린 바셀린 바셀린 거즈 3" x 8"	켄 달	414600	상처 드레싱

(영문) 호 년 년 가능 호 년 년