인간 PBMC가 이식된 인간화 이종이식 마우스 모델을 생성하는 기술

초록

출처: Li, Z., et al. A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 인간화된 이종 이식 마우스 모델을 생성하기 위한 분석을 보여줍니다. 면역이 저하된 마우스에게 시클로포스파마이드를 주사하여 면역 세포를 고갈시킵니다. 하이드로겔에서 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 혼합된 환자 유래 종양 세포를 마우스에 피하 주입하여 T 세포가 침투하는 종양을 형성합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. Human PBMC 기반 모델 구축

1. cyclophosphamide를 사용한 NOD/SCID 마우스의 골수절제술: 최적 용량 결정
   1. 암컷 비만하지 않은 당뇨병/중증 복합 면역결핍증(NOD/SCID) 마우스(6-8주)를 구입하십시오.
      메모: 이 연구에 참여한 모든 쥐는 여성이었다.
   2. 식염수에 다양한 용량(50, 100 및 150mg/kg)으로 시클로포스파마이드(CP)를 준비합니다. 125mg/kg.
      의 식염수 중 0.8% Tween-80의 디설피람(DS)을 준비합니다. 참고 : CP의 다른 용량을받는 마우스에 동일한 부피의 약물 용액을 투여 할 수 있도록 CP의 다른 농도를 준비했다.
   3. CP(복강내, i.p.)와 DS(peroral, p.o.)가 있는 동물을 하루에 한 번씩 2일 동안 치료합니다. CP.
      의 각 투여 후 DS (p.o.) 2 시간 참고: DS는 마우스에서 CP의 요로독성을 감소시키며, CP와 DS를 병용하면 CP만 투여받은 동물보다 호중구 감소증이 더 오래 지속되는 것으로 제안되었습니다. CP의 용량 요법은 실제 연구 전에 미리 결정해야 할 수 있으며 다른 면역 결핍 마우스 균주간에 약간 차이가 있는 것으로 밝혀졌습니다.
   4. 안와정맥동에서 혈액 샘플을 채취하여 0일(1차 투여 1시간 전), 2일(2^차 투여 후 24시간) 및 4일(2^차 투여 후 72시간)에 얼음 위의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA-K) 코팅된 튜브로 옮깁니다.
   5. FACS(Fluorescence-activated cell sorting)에 의한 CP 및 DS 치료 후 골수절제 효과를 조사합니다. CD11b+Ly6C를 호중구로^높게, CD11b⁺Ly6C를 단핵구로^높게 게이팅하기 위해 쥐 안티 마우스 CD11b(M1/70), 쥐 안티 마우스 Ly6C(HK1.4) 및 쥐 안티 마우스 Ly6G(1A8)를 사용합니다.
   6. 일주일 동안 매일 마우스의 체중과 건강 상태를 기록합니다. CP와 DS의 최적 용량은 마우스에 심각한 독성을 일으키지 않고 호중구와 단핵구를 최대한 고갈시키는 요법으로 결정됩니다.
2. 인간 PBMC 이식 및 종양 생착: 모델 설정
   1. 제조업체의 지침에 따라 밀도 구배 원심분리를 통해 건강한 공여자로부터 인간 PBMC를 분리합니다.
   2. 이식 효율을 높이기 위해 1.1.2 및 1.1.3 단계에서 표시된대로 CP 및 DS로 마우스를 전처리합니다.
   3. CP 및 DS의 두 번째 투여 후 20-24시간 후에 A431 세포(ATCC, 2.5 x 10⁶) 및 5 x 10⁶ 분리된 PBMC(총 200μL 인산염 완충 식염수(PBS)에 혼합, 50% Matrigel) 또는 종양 단편(3 x 3 x 3 mm³, 총 부피 200 μL PBS에서 50% Matrigel) 및 200 μL의 5 x 10⁶ PBMC(생착된 종양 단편의 좌측 및 우측에 각각 100μL)를 피하(s.c.) 동물의 우측에서 투
   여합니다.
   4. 원발성 종양 용적을 측정하고 4-6주 동안 일주일에 두 번 기록합니다.
      메모: 마우스는 체중이 20% 이상 감소하거나 종양 부피가 2,000mm3에 도달하거나 종양이 궤양이 발생하면 안락사됩니다.
   5. 이산화탄소가 있는 가스실에서 쥐를 안락사시킵니다. 희생된 마우스의 전체 종양 조직을 안과 가위로 수집하고 조직학 및 면역조직화학(IHC) 분석을 위해 처리합니다. 이러한 조직에서 Human CD8, PD-1 및 PD-L1 발현을 검사합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PBMC 분리/세포 배양
히스토파크-1077	시그마	10771	세포 분리
DMEM을 참조하십시오.	코 닝	10-013-CVR	세포 배양
디피에스	코 닝	21-031-CVR	세포 배양
FBS(증권 시세	코 닝	35-076-이력서	세포 배양
페니실린-스트렙토마이신, 액상	지브코	15140-163	세포 배양
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드	지브코	25200-114	세포 배양
마트리겔	코 닝	356237	CDX 접종
FACS 분석
소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease I	시그마	DN25	시료 전처리
콜라겐 분해 효소 유형 I	시그마	C0130	시료 전처리
Anti-mouse/human CD11b (M1/70) 항체	바이오레전드	101206	팩스
안티-마우스 Ly-6C (HK1.4) 항체	바이오레전드	128008	팩스
안티-마우스 Ly-6G (1A8) 항체	바이오레전드	127614	팩스
Anti-human CD8 (OKT8) 항체	선진 바이오텍	H10082-11H	팩스
Anti-human CD279 (MIH4) 항체	이바이오사이언스	Tel.: 12-9969-42	팩스
Anti-human CD3 (HIT3a) 항체	4A 생명 공학	--	팩스
Guava easyCyte 8HT 벤치탑 유세포 분석기	밀리포어	제0500-4008	팩스
종양/PDX 주입/투여/측정
시클로포스파미드	제이&케이	고양이#419656, CAS#6055-19-2	In vivo 효능
디설피람	제이&케이	고양이#591123, CAS#97-77-8	In vivo 효능
주사기	BD (영어)	300841	CDX 접종
피하 주사 바늘 (14G)	Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. (상하이 SA 메디시얼 & 플라스틱 인스트루먼트 Co., Ltd.)	0.7*32 TW SB	PDX 접종
버니어 캘리퍼스 (MarCal)	마흐	16ER	종양 측정
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