단순 포진 바이러스에 감염된 미성숙 수지상 세포에서 자가포식의 siRNA 기반 억제

초록

출처: Düthorn, A., et al. 단순 포진 바이러스 1형 감염 단핵구 유래 수지상 세포에서 자가포식을 조절하기 위한 siRNA 전기천공법. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 자가포식 플럭스를 방해하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 기반 기술을 보여줍니다. FIP200 mRNA를 표적으로 하는 siRNA는 전기천공법을 사용하여 단핵구 유래 미성숙 수지상 세포(iDC)에 도입되어 FIP200 발현을 knockdown하고 자가포식을 통해 핵 lamin 파괴를 억제합니다. 단순 헤르페스 바이러스(HSV)를 추가하면 자가포식 플럭스(autophagic flux)를 통한 라민 파괴가 없기 때문에 바이러스 자손의 핵 유출이 억제됩니다.

프로토콜

monocyte-derived DCs는 건강한 기증자의 백혈구 성분 채집술 산물에서 생성되었습니다. 이를 위해 지역 윤리 위원회에서 긍정적인 투표를 받았습니다(참조 번호 4556). 본 연구의 실험은 "Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg"(참조 번호 4556)의 윤리 위원회의 권고에 따라 수행되었습니다. 모든 기부자는 헬싱키 선언에 따른 것을 포함하여 서면 동의서를 승인했습니다.

1. 미성숙 수지상 세포(iDC) 및 성숙 수지상 세포(mDC)의 생성 및 처리

1. 앞서 설명한 바와 같이 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 백혈구 축소 시스템 챔버(LRSC)에서 분리합니다. PBMC의 동결 보존을 피하고 분리 시 직접 사용하여 더 높은 DC 수율을 얻을 수 있습니다.
2. 앞서 설명한 바와 같이 T175 세포 배양 플라스크에서 서로 다른 건강한 기증자의 PBMC에서 인간 DC를 생성합니다. 간단히 말해서, 세포 배양 플라스크당 30mL의 DC 배지(L-글루타민이 없는 RPMI 1640, 1%(v/v) 인간 혈청 AB형(AB-혈청), 100U/mL 페니실린, 100mg/mL 스트렙토마이신, 0.4mM L-글루타민, 10mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES))에 350-4억 개의 PBMC를 사용하여 단핵구를 순응하여 분리합니다. 1시간 후 RPMI 1640을 사용하여 비부착성 분획을 씻어냅니다. 800 U/mL 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF)와 250 U/mL 인터루킨-4(IL-4)가 보충된 새로운 DC 배지를 추가하고 3일 동안 배양합니다.
   1. 복용 일정 준수 후 3일차에 세포 배양 플라스크당 최종 농도가 각각 400 U/mL 및 250 U/mL인 GM-CSF 및 IL-4를 함유한 새로운 DC 배지 5mL를 첨가하여 DC 분화를 수행합니다.
   2. iDC를 채취하려면 부착 후 4일째에 세포 배양 플라스크 바닥에서 느슨하게 부착된 iDC를 부드럽게 헹굽니다. 이 단계를 2회 반복합니다. mDC 생성을 위해 다음과 같이 구성된 성숙 칵테일을 첨가합니다: GM-CSF(최종 농도: 40 U/mL), IL-4(최종 농도: 250 U/mL), 인터루킨-6(IL-6, 최종 농도: 1000 U/mL), 인터루킨-1 베타(IL-1β, 최종 농도: 200 U/mL), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α, 최종 농도: 10ng/mL), 프로스타글란딘 E2(PGE2, 최종 농도: 1μg/mL).
   3. 복용 일정 준수 후 6일(사이토카인 칵테일을 사용한 성숙 유도 후 2일)에 세포 배양 플라스크 바닥에서 mDC를 헹굽니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
      메모: 미성숙 및 성숙 DC는 1개의 세포 배양 플라스크에서 동일한 공여체로부터 순차적으로 생성될 수 있습니다. 이를 위해 (i) 적절한 수의 iDC를 분리하고 (ii) 1.2.2단계에 나열된 사이토카인 칵테일을 사용하여 플라스크에 남아 있는 세포의 성숙을 유도합니다.
3. 각 세포 배양 배지의 iDC 또는 mDC를 50mL 튜브로 옮깁니다. 300 x g에서 5분 동안 원심분리를 통해 세포를 수확합니다.
   1. 세포 배양 플라스크당 5-10mL의 RPMI 1640에 DC를 부드럽게 재현탁(=세척)합니다. 각각의 DC 서스펜션을 하나의 튜브에 결합하십시오.
   2. 계수 챔버 또는 대체 방법을 사용하여 세포 번호를 정의합니다. 표현형 변화의 위험을 줄이기 위해 iDC를 취급할 때 온도 변화를 피하십시오.

2. 표현형 성숙 상태를 모니터링하기 위한 유세포 분석

1. 1.3.1단계에서 iDC 또는 mDC(0.5 x 10⁶)를 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 3390 x g에서 1.5분 동안 원심분리를 통해 세포를 수확합니다. FACS 완충액(2% 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 PBS)로 세포를 한 번 세척합니다.
2. 정의된 표면 분자에 대해 특정 형광 표지 항체를 포함하는 100μL의 항체 염색 용액(FACS 버퍼)에 세포를 재현탁합니다.
   1. 다음 항체를 사용하여 DC(CD80-PacBlue[Pacific Blue]/-PE-cyanine5[Cy5], CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7)의 순도(CD3-fluorescein isothiocyanate[FITC], CD14-phycoerythrin[PE]) 및 성숙 상태를 확인합니다.
   2. 100μL의 FACS 완충액에 염색되지 않은 샘플 1개를 대조군으로 준비합니다.
   3. 어둠 속에서 얼음 위에 30분 동안 세포를 염색합니다.
3. 그 후 1mL의 FACS 완충액과 원심분리기에서 1.5분 동안 세포를 2회 세척합니다.
4. 마지막으로, 2% 파라포름알데히드(PFA)가 보충된 200μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁시키고 유세포 분석으로 세포를 분석합니다. 고정 세포는 최대 2일 동안 어두운 곳에서 4°C에서 보관할 수 있습니다.

3. FIP200-siRNA를 이용한 iDC의 전기천공을 통한 HSV-1 유도 자가포식 플럭스의 간섭

참고: siRNA 전기천공을 위한 현재 프로토콜은 Prechtel et al. (2007) 및 Gerer et al. (2017)에서 수정되었습니다.

1. 순응 후 3.5일째에 iDC(12 x 10⁶)를 50mL 튜브로 옮깁니다. 그 후, 300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 버립니다. 이와 동시에 유세포 분석을 수행하여 2단계(CD80-PacBlue 대신 Life/Dead violet 사용)에 설명된 대로 성숙 상태를 모니터링합니다.
2. 페놀 레드 없이 5mL의 OptiMEM으로 iDC를 부드럽게 세척하고 300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상등액을 버리고 페놀 레드가 없는 200μL의 OptiMEM에 iDC를 부드럽게 재현탁하여 세포 농도를 6 x 10⁶/100 μL로 조정합니다. 세포를 얼음 위에 올려 놓지 말고 온도 변화를 피하십시오. 신속하게 진행하고 페놀 레드가 없는 OptiMEM에서 iDC의 긴 잠복기를 피하십시오.
3. FIP200 특이적 siRNA 75 pmol 또는 스크램블된 siRNA 75 pmol을 대조군으로 4mm 전기 큐벳에 전달하고 100 μL(6x10⁶ cells)의 세포 현탁액을 추가합니다. electroporation apparatus I을 사용하여 iDC를 직접 pulseing하고 다음 설정을 적용합니다: 500 V for 1 ms.
   1. 실험 절차에 앞서 제조업체의 지침에 따라 siRNA 현탁액을 준비하고 분취 및 -20 °C에서 보관하십시오. 전기천공을 위해 이러한 siRNA를 사용할 때 해동하고 얼음 위에 보관하십시오. 샘플을 전기천공하기 전에 테스트 펄스를 수행합니다.
4. 전기천공(electroporation) 후, 예열된 새로운 DC 배지(GM-CSF 40 U/mL 및 IL-4 250 U/mL 추가)를 사용하여 iDC를 6-well 플레이트로 직접 옮깁니다. 세포를 최종 농도 1 x 10⁶/mL로 시딩하고 인큐베이터에 넣습니다. 전기 큐벳에서 세포를 헹구지 마십시오.
5. 48시간 후 먼저 전기천공된 iDC의 형태를 현미경으로 검사합니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확하고 15mL 튜브로 옮깁니다. 0.01% 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 보충된 PBS 1mL로 웰을 헹구고 용액을 각 튜브에 옮깁니다.
6. 그런 다음 다음 단계에 설명된 대로 siRNA 조건당 6 x 10⁶ iDC를 분할합니다.
   1. 0.5 x 10⁶ 세포를 사용하여 2단계에서 설명한 대로 성숙 상태와 세포 생존율을 평가합니다. CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 및 Life/Dead violet 항체를 사용하십시오.
   2. 웨스턴 블롯 분석에 1 x 10⁶ 셀을 사용하여 FIP200 특이적 녹다운 효율을 검증합니다. 3390 x g에서 1.5분 동안 원심분리를 통해 세포를 1.5mL safelock tube로 옮기고 수확합니다. 세포 용해물을 준비하고 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다.
   3. 나머지 세포(4.5 x 10,⁶)를 HSV-1 감염 실험에 사용합니다. 각 실험 조건에 대해 2.25 x 10⁶ iDC를 2mL 튜브로 옮기고 2의 다중감염성(MOI)에서 HSV1로 감염시키거나 MNT 버퍼를 모의 대조군으로 추가합니다. 설명된 대로 감염을 수행합니다.
   4. 감염 후 20시간(hpi)에 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확하고 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포 용해물을 준비합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4D-Nucleofector Core Unit (전기천공장치 II)	론차 (바젤, 스위스)	AAF-1002B
AB-세럼	Sigma Aldrich Chemie GmbH (독일 스타인하임)	H4522	수지상 세포 배양
ACD-에이	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (독일 슈타인하임)	9007281
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L(전기천공법 키트 장치 II)	론차 (바젤, 스위스)	V4XP-3024
Amersham ECL 프라임 웨스턴 블로팅 검출 시약	GE Healthcare(독일 졸링겐)	RPN2232	웨스턴 블롯 검출
과황산암모늄(APS)	Sigma Aldrich Chemie GmbH (독일 스타인하임)	A3678
안티-마우스 IgG(마우스, 다클론성, HRP)	Cell Signaling(네덜란드 라이덴)	7076	웨스턴 블롯 검출
항토끼-IgG (염소, 다클론성, HRP)	Cell Signaling(네덜란드 라이덴)	7074	웨스턴 블롯 검출
BD FACS Canto II 유세포 분석기	BD Biosciences (독일 하이델베르크)	338962
블로팅 챔버 Fastblot B44	Biometra (괴팅겐, 독일)	846-015-100
CCR7(마우스, Pe-Cy7)	BioLegend (Fell, 독일)	557648	유세포 분석 희석량: 1:100 클론: G043H7
CD11c(마우스, Pe-Cy5)	BD Biosciences (독일 하이델베르크)	561692	유세포 분석 희석량: 1:100 클론: B-ly6
CD14 (마우스, PE)	BD Biosciences (독일 하이델베르크)	555398	유세포 분석 희석량: 1:100 클론: M5E2
CD3 (마우스, FITC)	BD Biosciences (독일 하이델베르크)	555332	유세포 분석 희석량: 1:100 클론: UCHT1
CD80(마우스, V450)	BD Biosciences (독일 하이델베르크)	560442	유세포 분석 희석량: 1:100 클론: L307.4
CD83(마우스, APC)	eBioscience Thermo Fisher Scientific (독일 랑겐셀볼드)	Tel.: 17-0839-41	유세포 분석 희석량: 1:200 클론: HB15e
CD86 (마우스, PE)	BD Biosciences (독일 하이델베르크)	553692	유세포 분석 희석: 1:100
EVOS FL 세포 이미징	System AMG/Life Technologies (미국 칼즈배드)	AMF4300
FIP200 (토끼)	Cell Signaling(네덜란드 라이덴)	12436	웨스턴 블롯 감지 희석량: 1:1000 클론: D10D11
Gene Pulser II 장치 (electroporation apparatus I)	BioRad Laboratories GmbH (독일 뮌헨)	165-2112
GM-CSF (4x104 U/mL)	Miltenyi Biotec (베르기슈 글라트바흐, 독일)	Tel.: 130-093-868
HLA-DR(마우스, APC-Cy7)	BioLegend (Fell, 독일)	307618	유세포 분석 희석량: 1:200 클론: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43	바이오벡스		직류 감염
IL-1β (0.1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH (독일 프라이부르크)	1411-050
IL-4 (1x106 U/mL)	Miltenyi Biotec (베르기슈 글라트바흐, 독일)	Tel.: 130-093-924
IL-6 (1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH (독일 프라이부르크)	1404-050
이미지퀀트 LAS 4000	GE Healthcare(독일 졸링겐)	28955810
L-글루타민	론차 (바젤, 스위스)	17-605E
LIVE/DEAD 고정성 바이올렛 데드 셀 스테인 키트	Life Technologies(미국 캘리포니아주 칼즈배드)	L34964	유세포 분석에서 L/D 염색
림프렙	Alere Technologies AS(노르웨이 오슬로)	04-03-9391/01
염화마그네슘	Carl Roth GmbH (독일 카를스루에)	답537.1
메가퓨지 2.0 RS	헤레우스 (하나우, 독일)	75015505
노이바우어 계수 챔버	Brand (베르트하임, 독일)	717805
Nunc 세포 배양 플라스크 (175.0 cm2)	Thermo Scientific (록포드, 미국)	159910
파라포름알데히드, 16 %	Alfa Aesar, 하버힐, 미국	43368.9엠
퍼펙트스핀 24 플러스	Peqlab (독일 에를랑겐)	C2500-R-PL
PGE2 (1 mg/mL)	Pfizer (독일 베를린)	BE130681
인산염 완충 식염수(PBS)	론차 (바젤, 스위스)	17-512층
RestoreTM 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼	Thermo Scientific, 미국 록포드	21059
흔들 플랫폼 wt 15	Biometra (괴팅겐, 독일)	제042-590
로티블록	Carl Roth GmbH (독일 카를스루에)	답151.4
로티로드 1 (4x)	Carl Roth GmbH (독일 카를스루에)	K929.3
로티포레제 젤 30 (37.5:1)	Carl Roth GmbH (독일 카를스루에)	3029.1
RPMI 1640	론차 (바젤, 스위스)	12-167층
도데실황산나트륨(SDS)	Carl Roth GmbH (독일 카를스루에)	2326.2
써모믹서의 편안함	Eppendorf (함부르크, 독일)	5355 000.011
TNF-α (10 μg/mL)	Peprotech (함부르크, 독일)	300-01ᅡ
트리스	Carl Roth GmbH (독일 카를스루에)	4855.3
트리판 블루 용액 (0.4 %)	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (독일 슈타인하임)	T8154
트윈 20	Carl Roth GmbH (독일 카를스루에)	9127.1
Whatman 0.2μm 니트로셀룰로오스 멤브레인	GE Healthcare(독일 졸링겐)	10600001
WhatmanTM 크로마토그래피 용지 3mm Chr	Fisher Scientific GmbH (독일 슈베르테)	3030917

시리즈 년 년 년 년 년 년 호 년