Evaluating the anti-tumor efficacy of a bacterial immunomodulatory protein in a murine model(쥐 모델에서 박테리아 면역조절 단백질의 항종양 효능 평가)

초록

출처: Codolo, G. et al. 정소성 쥐 모델에서 방광암 치료를 위한 치료 도구로서의 H. pylori 단백질 HP-NAP의 효능 평가.J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 마우스 방광암 모델에서 Helicobacter pylori 호중구 활성화 단백질(HP-NAP)의 항종양 활성을 평가하는 기술을 보여줍니다. HP-NAP는 종양세포 호중구와 상호 작용하여 전염증성 사이토카인을 생성함으로써 미접촉 T 세포를 1형 T helper(Th1) 및 1형 세포독성(Tc1) T 세포 표현형으로 분화시킵니다. Th1 및 Tc1 세포는 인터페론-감마를 분비하여 종양 혈관 신생을 억제하고 세포독성 T 세포 매개 종양 파괴를 촉진하여 종양 부피를 감소시킵니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물

1. C57BL6/J 암컷 마우스를 미세 격리 필터가 있는 개별 환기 케이지에서 8주까지 성장시킵니다.
   참고: 암컷이 선호되는 이유는 외부 비뇨생식기 장치의 해부학적 구조로 인해 수컷보다 카테터 삽입이 더 쉽기 때문입니다.

2. 세포 배양

1. 10% 열 비활성화 소 태아 혈청과 50μg/ml 겐타마이신이 보충된 RPMI 1640 배지에서 마우스 요로상피암 세포주 MB49를 가습된 5% 이산화탄소(CO₂)에서 37°C로 유지합니다.
2. T-75 플라스크에서 MB49 세포를 80% 합류점으로 성장시킵니다. 트립신화(Trypsinize)는 마우스에 이식하기 전에 인산염 완충 식염수(PBS) 150μl당 0.5 ×^{10 5} - 0.5 ×^{10 6}개 세포에서 재현탁합니다.

3. 방광 내 종양 임플란트

1. 마취제인 졸레틸(zoletil)과 자일러(xylor, 각각 33mg/kg 및 20mg/kg)를 혼합하여 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다.
2. 동물을 누운 자세로 놓고 뒷다리를 스카치 테이프로 패드에 고정합니다. 발은 요도 고기가 잘 보이고 카테터 삽입을 위해 쉽게 접근할 수 있도록 충분히 떨어져 있어야 합니다.
3. 참고: 카테터 삽입의 경우 24G 소아 정맥 카테터가 8-10주 된 마우스에 적합합니다. 카테터의 선택은 요도와 카테터 사이의 액체 누출을 방지하는 데 중요합니다. 더 크거나 더 나이가 많은 마우스에는 더 큰 보어 카테터를 사용해야 합니다.
4. 작은 집게발을 사용하여 요도 바깥쪽의 한쪽 가장자리를 꼬집고 쥐의 "머리 끝"쪽으로 매우 부드럽게 비틀십시오. 이 작용은 요도 고기를 노출시킵니다.
5. 카테터의 내부 바늘을 제거하고 후자를 마우스의 "꼬리 끝"쪽으로 약간 향하게 45° 각도로 요도에 삽입합니다. 카테터의 입구를 억지로 넣지 마십시오. 저항이 있는 경우 카테터가 요도 안으로 들어갈 때까지 카테터를 아주 부드럽게 비틀기만 하면 됩니다. 카테터의 약 0.5-0.8cm가 요도에 있을 때 카테터를 마우스의 꼬리와 평행하게 조심스럽게 놓고 완전히 삽입하십시오.
6. 바늘을 카테터에 삽입해야 하는 1ml 주사기를 사용하여 200-300μl의 멸균 PBS를 주입하여 방광에 남아 있는 소변에서 방광을 씻고 방광의 모든 액체를 흡인합니다.
7. 참고: PBS를 주입하면 방광이 가득 차고 생쥐의 뒷다리 사이가 부어오를 수 있습니다. 이는 카테터 삽입이 정확하다는 것을 확인합니다. 대부분의 카테터에는 주입량을 계산할 때 고려해야 하는 데드 볼륨이 있습니다.
8. 멸균 1ml 주사기를 사용하여 200μl의 0.1N 염산(HCl)을 주입합니다. 방광을 채워 벽 전체를 태우십시오. 10초 후 모든 산을 제거하고 멸균 주사기로 200μl의 0.1N 수산화나트륨(NaOH)을 주입하여 즉시 중화합니다. 가장 많은 수의 세포(0.5 × 10⁶)를 주입하는 경우 산성화 단계가 필요하지 않습니다.
9. 잔류 액체를 모두 흡입하고 즉시 300μl의 멸균 PBS로 캐비티를 플러시합니다.
10. 흡인으로 방광을 비우고 MB49 세포(범위 0.5 ×^{10 5} - 0.5 × 10⁶)를 포함하는 PBS 150μl를 방광에 주입합니다. 세포의 누출을 방지하기 위해 주사기를 카테터에 조립된 상태로 두십시오. 주사기는 스카치 테이프로 패드에 고정하여 고정하는 것이 좋습니다.
11. 1시간 후, 요도에서 카테터를 부드럽게 추출하고 쥐가 깨어날 때까지 백열등 아래 케이지에 쥐를 놓습니다: 이것은 일반적으로 치료 종료 후 1시간에서 2시간 사이에 발생합니다.

4. Helicobacter pylori 호중구 활성화 단백질(HP-NAP)의 방광 내 전달

1. 참고: 세포 점안 후 최소 3일이 지나면 치료를 시작할 수 있습니다.
2. 3.1-3.4단계에 설명된 대로 카테터화합니다. 이 단계에서는 HCl로 방광 벽을 태울 필요가 없습니다.
3. 1ml 주사기를 사용하여 200-300μl의 멸균 PBS를 주입하여 잔여 소변에서 방광을 씻고 방광의 모든 액체를 흡인합니다.
4. 150μl PBS당 50μg의 HP-NAP을 방광에 주입합니다. 단백질 용액의 누출을 방지하기 위해 주사기를 카테터에 부착된 상태로 두십시오. 주사기를 스카치 테이프로 패드에 고정하여 고정합니다.
5. 1시간 후, 요도에서 카테터를 부드럽게 추출하고 쥐가 깨어날 때까지 백열등 아래 케이지에 넣습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6J 암컷 마우스	Harlan Italy (우디네, 이탈리아)
MB49 셀			미국 아이오와주 아이오와대학교 카버 의과대학의 오도넬 교수로부터 획득
RPMI	Sigma-Aldrich (미국 미주리주 세인트루이스)	R8758
FBS(증권 시세	시그마-알드리치	F7524
PBS (PBS)	시그마-알드리치	D1408	10X, apyrogenic 물에 희석
플라스크	Becton Dickinson (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)	353135
주사기 1ml	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	301358
트립신	Life Technologies (미국 매사추세츠주 월섬)
겐타마이신	생명 기술	제15710-049
자일러	Bio 98 s.r.l. (밀라노, 이탈리아)		자일라진 2%
졸레틸	Virbac (Carros, 프랑스)	3.59713E+11	5% 졸라제팜 + 5% 틸레타민
24G 카테터	Terumo (이탈리아, 로마)	SR+DM2419PX
염산(HCl)	Carlo Erba 시약(이탈리아 밀라노)	403871	액체
나오	JT Baker (미국 펜실베이니아주 센터밸리)	10095011	가루

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