바이러스 항원 특이적 T 세포를 이용한 B형 간염 바이러스 복제 억제

Abstract

출처: Xiong, X., et al. 줄기 세포 유래 바이러스 Ag 특이적 T 림프구는 마우스에서 HBV 복제를 억제합니다. J. Vis. Exp. (2019).

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 CD8+ T 세포를 사용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제를 억제하는 분석을 보여줍니다. HBV 특이적 수용체로 조작된 이 T 세포는 형질전환 마우스로 전달됩니다. 그런 다음 복제 가능한 HBV 게놈 플라스미드를 간에 직접 주입하여 바이러스 DNA 흡수를 가능하게 합니다. 바이러스 항원이 하이브리드 MHC-I 분자에 의해 발현되고 제시되면 조작된 T 세포는 이러한 복합체를 인식하고 결합합니다. 이는 세포독성 분자의 방출을 유발하여 HBV에 감염된 간 세포를 파괴하고 바이러스 복제를 억제합니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 local
에서 검토했습니다. 기관 동물 관리 위원회 및 JoVE 수의학 검토 위원회. 샘플 수집과 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. iPSC(iPSC-CD8⁺ T 세포)에서 바이러스 Ag 특이적 CD8⁺ T 세포 생성

1. 레트로바이러스 구조체의 생성
   메모: T 세포 수용체(TCR) α 및 β 유전자는 2A 자가 절단 서열과 연결되어 있습니다. 레트로바이러스 벡터 MSCV-IRES-DsRed(MiDR)는 DsRed+입니다.
   1. 서브클론 HBs183-191(FLLTRILTI) 특이적 A2 제한 인간-쥐 하이브리드 TCR(s183 TCR) 유전자(Vα34 및 Vβ28)를 MiDR에 넣어 s183 MiDR 구조물을 생성합니다(그림 1A).
2. 레트로바이러스 형질도입
   참고: Platinum-E(Plat-E) 세포는 레트로바이러스 형질도입에 사용될 레트로바이러스(s183 TCR 유전자 운반)를 포장하는 데 사용됩니다. Plat-E 세포는 293T 세포의 기초가 되는 효과적인 레트로바이러스 패키징 세포로, 개그, 폴 및 에코트로픽 환경을 포함한 레트로바이러스 구조 단백질을 발현하기 위해 EF1α 프로모터를 통한 고유한 패키징 구조를 통해 개발되었습니다.
   1. 100mm 배양 접시에서, 형질감염 1일 전에 5% CO₂와 함께 37°C의 인큐베이터에서 10% 송아지 태아 혈청(FCS)을 함유한 8mL의 DMEM 배양 배지에 3 x 10⁶ Plat-E 세포를 시드합니다.
   2. 0일째에 DNA 형질감염 시약을 사용하여 s183 MiDR 구조물을 Plat-E 세포에 형질감염시킵니다.
   3. 1일째에 1 x 10⁶ iPSC(녹색 형광 단백질[GFP]+)를 젤라틴 사전 코팅 배양 플레이트에 시드합니다.
   4. 2-3일째, Plat-E 세포 배양에서 레트로바이러스 함유 상청액을 수집하여 1,6-디브로모헥산 용액의 존재 하에서 s183 TCR로 iPSC를 형질도입합니다.
   5. 4일째에 s183 TCR 유전자 형질도입된 iPSC를 트립신화하고, 400 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 3 x 10⁶ 조사된 SNL76/7(irSNL76/7) 피더 세포로 사전 코팅된 100mm 배양 접시에 3 × 10⁵개의 iPSC를 시드합니다.
   6. 합류 5일 또는 6일째에 세포를 트립신화하고 400 x g에서 5분 동안 원심분리한 다음 세포 분류를 위해 처리합니다. 살아있는 세포에서 게이팅, 고속 세포 분류기를 사용하여 GFP 및 DsRED 이중 양성 세포(s183 TCR 유전자 형질도입 iPSC)를 분류합니다. 1.2.5단계와 유사하게, 나중에 사용할 수 있도록 irSNL76/7 피더 세포에서 분류된 세포를 공동 배양합니다.
3. HBV 특이적 iPSC-CD8+ T 세포의 분화
   참고: OP9-DL1/DL4 간질 세포는 Notch 리간드 DL1 및 DL4를 모두 과발현하며, iPSC를 iPSC와 공동 배양하면 Notch 신호 매개 T 세포 분화를 촉진할 수 있습니다.
   1. 20% 소 태아 혈청(FBS)α을 포함하는 최소 필수 배지(MEM) 배지에서 OP9-DL1-DL4 세포 단층에서 s183 TCR 유전자 형질도입 iPSC(s183/iPSC)를 배양합니다. 배양액에 쥐 FMS 유사 티로신 키나아제 3(Flt3) 리간드(mFlt-3L; 최종 농도 = 5ng/mL)를 포함합니다.
   2. 0일째, 이전에 OP9-DL1-DL4 세포로 배양한 10cm 배양 접시에 0.5-1.0 x 10⁵ S183/iPSC를 시드합니다. OP9-DL1-DL4 세포가 80%–90% 컨플루언트 상태인지 검증합니다.
   3. 5일째에 iPSC를 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹구고 PBS를 흡인한 다음 이를 4mL의 0.25% 트립신에 첨가한 다음 37°C 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, 트립신 분해를 종료하기 위해 8mL의 iPSC 배지를 보충합니다. 세포를 포함하는 모든 소화 용액을 축적하고 15-30°C에서 5분 동안 400 x g로 원심분리합니다.
   4. 상청액을 흡인하고 세포를 10mL의 iPSC 배지에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 새로운 10cm 페트리 플레이트로 옮기고 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
   5. 30분 후, 부유 세포를 포함하는 iPSC 배지를 수집합니다. 세포 현탁액을 70μm 세포 여과기에 통과시키고 세포 수를 계산합니다.
   6. 1.3.1.
      단계에서 설명한 바와 같이 이전에 성장한 OP9-DL1-DL4 세포를 80%–90% 컨플루언트 조건으로 배양 접시에 5 x 10⁵ 세포를 시드합니다. 메모: T 세포 분화를 위해 2-3일마다 iPSC 유래 세포는 OP9-DL1-DL4 세포의 새로운 층으로 다시 파종해야 합니다.
4. 평가
   1. 분화 iPSC의 형태학적 변화
      1. 다양한 날에 현미경으로 세포를 관찰하십시오.
         메모: 5일째까지 콜로니는 중배엽과 유사한 특성을 가지며 인간 진피 섬유아세포와 유사한 고전적인 방추 모양의 형태를 나타내고 시험관 내에서 지속적인 성장을 나타냅니다. 8일째가 되면 작고 둥근 세포 덩어리가 나타나기 시작합니다.
   2. 유세포 분석을 통한 iPSC 분화 분석
      1. 공동 배양의 다양한 날에 이전에 설명한 대로 iPSC 유래 세포를 분석합니다(그림 1B,C).
   3. iPSC 분화의 기능 분석
      1. 공동 배양 28일째에 부유 세포를 수확하여 배양에서 iPSC-CD8+ T 세포를 수집하고, 남은 세포를 0.25% 트립신으로 트립신화하고, 8mL의 iPSC 배지에 재현탁하고, 15-30°C에서 400 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 배지를 제거한 다음 10mL의 배지에 세포를 재현탁합니다.
      2. 재현탁된 세포를 37°C 인큐베이터의 신선한 10cm 접시에 30분 동안 보관하고 부유 세포를 조립합니다. 그런 다음 차가운 PBS로 세포를 한 번 헹굽니다.
      3. H-2 클래스 I 녹아웃, HLA-A2.1-형질전환(HHD) 마우스의 비장에서 3 x 10 6 T 세포 고갈 비장세포(^CD4-CD8-)를 5μM s183 펩타이드(FLLTRILTI)와 함께 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
      4. s183 펩타이드로 펄스된 비장세포와 iPSC-CD8⁺ T 세포의 혼합물을 생성합니다(T 세포: 비장세포 = 1:4, 0.75 x 10⁶ T 세포 사용). 세포 혼합물을 CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 40시간 동안 배양합니다. 마지막 7시간 동안 4μL의 희석된 브레펠딘 A를 배양액(최종 농도 1,000x, 1x 배양 배지에서 희석됨)에 첨가하여 세포 활성화 중 수송 과정을 차단합니다.
      5. 세포를 염색하고 앞서 설명한 대로 세포내 인터페론-감마(IFN-γ)의 유세포 분석을 수행합니다(그림 2).

2. HBV 플라스미드의 유체역학적 전달을 통한 HBV 복제 유도

참고: pAAV/HBV1.2 구성은 앞서 설명한 대로 생성되었습니다. HBV 1.2 완전 DNA는 벡터 pAAV에 통합됩니다.

1. 꼬리 정맥을 통한 HBV 플라스미드의 유체역학적 전달
   1. 꼬리 정맥을 확장하기 위해 케이지에서 열 램프를 사용하여 5분 동안 HHD 마우스를 가열합니다.
   2. 구속 장치를 사용하여 동물을 구금하고 70% 에탄올 스프레이로 쥐 꼬리를 청소하십시오.
   3. 플라스미드를 간으로 전달합니다.
   4. 측정 저울을 사용하여 마우스의 체중을 측정합니다.
   5. 체질량 PBS의 8% 등가량(예: 20g 마우스의 경우 1.6mL)에 HBV 플라스미드 10μg을 희석합니다. 희석된 플라스미드를 3mL 주사기에 26G × 1⁄2"(0.45 × 12mm) 피하 주사 바늘로 로드합니다.
   6. 꼬리의 중간 1/3에 있는 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나를 찾아 바늘을 양쪽 측면 정맥에 배치합니다. 3 - 5초 이내에 꼬리 정맥을 통해 HBV 플라스미드를 함유한 주사를 투여합니다.
2. 감염된 마우스의 혈청에서 바이러스혈증의 정량화
   메모: HBV 복제는 마우스 혈청에서 3-35일째에 발생합니다. DNA 복제는 7일째에 최고조에 달하고 점차적으로 감소합니다. HBV DNA는 35일까지 혈청에서 제거되지 않습니다.
   1. 감염된 쥐로부터 혈청 수집
      1. 감염 후 3, 5, 7 및 10일에 각 마우스로부터 약 0.1mL의 혈액을 1.5mL 미세원심분리관에서 안와후 출혈에 의해 수집한 다음 실온(RT)에서 20분 동안 배양합니다.
      2. 샘플을 4°C에서 15분 동안 6,000 x g로 원심분리하고 원심분리 후 혈청 상청액을 수집합니다.
   2. 제조업체의 권장 사항에 따라 시중에서 판매되는 DNA 추출 키트를 사용하여 혈청에서 DNA를 정제합니다. 간단히 말해서, 실리카 기반 컬럼에서 세포를 용해하고, 세척을 수행하고, 용출 컬럼에 100% 에탄올을 첨가하고 6000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 DNA를 추출합니다. RNase가 없는 물 50μL에서 DNA를 용리합니다.
   3. 실시간 PCR 분석을 위해 용출액에서 추출한 HBV DNA 100ng를 사용합니다. 다음 프라이머 및 프로브를 사용하십시오: forward 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'; 역방향 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; 프로브 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
      1. 표준 곡선에 플라스미드(pAAV/HBV1.2)를 포함하는 HBV 게놈을 사용하고 총 부피 10μL에서 실시간 PCR을 수행합니다(그림 3).
   4. 표 1과 같이 총 부피 10μL로 PCR 반응을 설정합니다.
   5. 표 2와 같이 열순환기에서 PCR 프로그램을 설정합니다. 프로그래밍된 온도 전이 속도는 변성/어닐링의 경우 20°C/s, 확장의 경우 5°C/s입니다. 실시간 PCR 모니터링을 위해 각 사이클의 어닐링 단계 종료 시 형광을 측정합니다.

3. 바이러스 Ag 특이적 iPSC-CD8+ T 세포의 ACT에 의한 HBV 복제 감소

1. 입양 세포 이식(ACT)
   1. 섹션 1.3에 설명된 대로 8일 동안 mFlt-3L 및 mIL-7의 존재 하에서 OP9-DL1-DL4 간질 세포에서 s183/iPSC(1.3.7)를 분화합니다.
   2. 22일째에 트립신이 있는 10cm 플레이트에서 iPSC-CD8+ T 세포를 수집한 다음 각 10cm 플레이트를 세척하고 신선한 배지 10mL에 재현탁합니다. 세포를 신선한 10cm 플레이트에 추가하고 섹션 1.3에서 수행한 대로 30분 동안 인큐베이터로 돌아갑니다. 30분 후 부유 셀을 수집합니다.
   3. 70μm 나일론 스트레이너를 사용하여 세포를 통과시켜 세포 클러스터를 제거하고 세포 수를 계산합니다. 차가운 PBS 용액에서 세포를 1.5 x 10⁷ cells/mL의 농도로 조정하고 필요한 경우 70μm 나일론 스트레이너를 사용하여 세포를 통과시켜 세포 클러스터를 다시 제거합니다. ACT까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
   4. 꼬리 정맥을 통해 200 μL 세포 현탁액(3 x 10⁶ 세포)을 4-6주 된 HHD 마우스에 주입합니다.
2. HBV 복제 유도
   1. 세포 이식 후 14일째에, 섹션 2.1에 설명된 대로 꼬리 정맥을 통해 HBV 플라스미드의 유체역학적 전달을 수행합니다.

표 1: PCR 반응량

<테이블 border='1' fo:keep-together.within-page='1' fo:keep-with-next.within-page='항상'> DNA 주형 2ml DNA 마스터 혼성화 혼합물((Taq DNA 중합효소, PCR 반응 완충액, 10 mM MgCl₂ 및 dNTP 혼합물) 1ml 25 mM MgCl₂ 0.8 ml 0.3 μM 프로브 3 ml 각 프라이머 5μM 3.2 ml 합계 10ml

표 2: PCR 프로그램

<테이블 border='1' fo:keep-together.within-page='1' fo:keep-with-next.within-page='항상'> 변성 온도
95 °C 시간
5초 어 닐 링 53 °C 10초 확장 72 °C 20초 5 °C

Results

그림 1: HBV 바이러스 Ag 특이적 iPSC-CD8⁺ T 세포의 생성.

마우스 iPSC는 HBs183-91 TCR (MiDR-s183 TCR) 또는 OVA257-264 TCR (MiDR-OVA TCR)과 같은 레트로바이러스 구축물로 형질도입되고, 형질도입된 iPS세포는 T 계통 분화를 위해 OP9-DL1/DL4 간질 세포와 공동 배양된다. (A) s183 특이적 TCR을 발현하는 레트로바이러스 구조물 MiDR-s183 TCR의 개략도. Ψ = 포장 신호; 2A = 피코나바이러...

Materials