쥐 모델에서 자가면역 관절염에 대한 세포 기반 치료법

초록

출처: Haque, M. et al., 자가면역에 대한 줄기세포 유래 항원 특이적 조절 T 세포의 개발.J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 마우스의 자가면역 관절염에 대한 세포 기반 치료법을 보여줍니다. 오브알부민 특이적 수용체를 발현하는 iPSC 유래 T 조절 세포에 보조제에서 유화된 메틸화된 소 혈청 알부민(mBSA)을 주입합니다. 쥐 항원제시세포(APC)는 mBSA를 처리하여 T세포에 전달하여 T세포가 활성화되고 무릎 관절의 활액막으로 이동하도록 유도합니다. 후속 주사에는 왼쪽 무릎에 mBSA만 투여하고 오른쪽 무릎에 mBSA와 오브알부민을 조합하여 투여합니다. 왼쪽 무릎에서는 mBSA에 대한 면역 반응이 관절염을 유발하는 반면, 오른쪽 무릎에서는 오브알부민과 상호 작용하는 T 조절 세포가 염증을 완화하여 관절염 증상을 개선합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 자가면역 관절염의 생체 내 성숙 및 억제

1. OT-II T 세포 수용체(TCR) 유전자 및 포크헤드 박스 단백질 3(FoxP3)을 자가 절단 펩타이드 2A와 연결된 MiDR 플라스미드에 sub-cloning하여 레트로바이러스 형질도입에 사용할 구축물을 생성하여 MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3 구축물을 만듭니다.
2. Plat E 세포를 패키징 세포주로 사용하여 유도만능줄기세포(iPSC)의 레트로바이러스 형질도입을 수행합니다.
3. 생쥐의 생체 내 분화 및 관절염 유도.
   1. 사이토카인 mFlt-3L 및 mIL-7이 있는 상태에서 OP9-DL1-DL4-I-A^b 기질 세포에서 8일 동안 OT-II TCR/FoxP3-FoxP3/iPSC, FoxP3-transduced iPSC 및 DsRed 형질주입 iPSC를 구별합니다.
   2. 0일차에 OP-9 배지(20% 태아 송아지 혈청(FCS) 및 2.2g/L 중탄산나트륨을 함유하는 α-MEM 배지)를 사용하여 OP9-DL1-DL4-I-A^b 세포를 최소 밀도 10⁴ cells/cm²로 시딩합니다. 접시 1 x 10 10cm 접시^{당 6} 셀.
   3. 3일차에 OP9-DL1-DL4-I-A^b 세포가 80-90% 융합되면 배지를 제거하고 OP-9 배지의 OP9-DL1-DL4--I-A^b 세포에 0.5 - 1 x 10⁵ iPSC를 시드합니다.
      참고: 이는 OP9-DL1-DL4-I-A^b 세포에서 iPSC의 공동 배양을 확립하고 분화 0일로 간주됩니다.
   4. 5일차에 흡인으로 10cm 접시에서 배지를 제거하고 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 10ml로 세포를 세척한 다음 PBS를 흡인합니다. 0.25% 트립신 4ml를 넣고 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 세포에 8ml의 iPSC 배지를 더 추가하고 다시 현탁시킨 다음 실온에서 5분 동안 400 x g으로 원심분리합니다.
      1. 상층액을 흡인하고 10ml의 iPSC 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 이 재현탁 세포를 10cm 접시에 담아 배양하고 30분 동안 인큐베이터로 돌아갑니다.
         참고: OP9-DL1-DL4-I-A^b 피더 셀을 제거하고 배지에 분화 iPSC를 보관합니다. 추가 공동 배양을 위해 80 - 90% 포화도를 달성하기 위해 OP9-DL1-DL4-I-A^b 세포를 지속적으로 유지합니다.
      2. 30분 후 부유 세포를 채취하여 70μm 세포 스트레이너를 통해 여과한 다음 혈구계로 계수합니다.
   5. 5 x 10⁵의 iPSC를 OP9 배지에서 OP9-DL1-DL4-I-A^b 세포의 새로운 80 - 90% 융합에 시딩합니다. 최종 5ng/ml 농도의 mFlt-3L을 배지에 보충합니다.
   6. 10cm 플레이트에서 세 가지 종류의 세포를 모두 트립신화하고 각 10cm 플레이트의 세포를 10ml의 새로운 배지에 다시 현탁시킵니다. 새 10cm 플레이트에 세포를 넣고 30분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 30분 후 부동 셀을 수집합니다.
   7. 70μm 세포 스트레이너에 세포를 통과시켜 세포 클러스터를 제거하고 혈구계를 사용하여 계수합니다. 차가운 PBS에서 세포를 1.5 x 10⁷ cells/ml의 농도로 조정하고 필요한 경우 다시 필터링합니다. 입양 세포가 생쥐로 옮겨질 때까지 세포를 얼음 위에 두십시오.
   8. 200 μl의 세포 현탁액(3 x 10,⁶ 세포)을 꼬리 정맥을 통해 4 - 6주 된 암컷 C57BL/6 마우스의 3개 그룹에 주입합니다.
   9. 10일째, 세포 이식 후 1ml 주사기를 사용하여 Freund의 완전 보조제에서 유화된 100μg의 메틸화 소 혈청 알부민(mBSA)을 쥐의 꼬리 기저부에 주입합니다.
   10. 17일째에 이소플루란 기화기를 사용하여 마우스를 마취합니다. 유도를 위해 4 - 5% 이소플루란을 사용하고 유지 관리를 위해 1 - 2%를 활용합니다. 왼쪽 무릎 관절에 10μl PBS에 20μg mBSA를 관절 내 주사하고 오른쪽 무릎 관절에 10μl PBS에 20μg mBSA 및 100μg 전체 오브알부민(OVA)을 관절 내 주사하여 관절염을 유발합니다. 관절염이 발생한 후에는 음식과 젤 팩을 침구 바닥에 놓을 수 있습니다. 마우스는 안락사됩니다: 신체 상태 점수(BCS) 2/5 또는 빈사 상태, 심한 악액질 및/또는 지속적인 누워있음(24시간 주기), 중증도 점수 4. 점수 4에서는 발목을 둘러싼 홍반과 심한 부기가 있습니다. 발, 손가락 또는 팔다리의 강직성.
4. OT-II TCR/FoxP3 형질 주입 iPSC의 특성화.
   1. 형광 현미경(20X)을 사용하여 고정되지 않은 살아있는 DsRed⁺ GFP⁺ 세포를 시각화합니다.
   2. Western blot 및 유세포 분석을 통한 유전자 통합 및 발현을 조사합니다.
5. 관절염 억제 분석
   1. 관절염이 유발되기 전에 마우스의 양쪽 무릎의 부종을 다이얼 게이지 캘리퍼를 사용하여 기준선을 설정하여 측정합니다.
   2. 관절염 유도 및 Treg 이식을 위한 단계(1.3.1 - 1.3.10)를 따릅니다. 다이얼 게이지 캘리퍼 포스트 Treg 전송으로 마우스 무릎을 측정합니다.
   3. 무릎 직경의 증가 퍼센트 계산: 퍼센트 증가 = (1일차 무릎 직경 - 0일차 무릎 직경) / 0일차 무릎 직경.
6. 조직학에 의한 무릎의 관절 파괴 및 염증 세포 침투 측정(그림 1).
   1. 관절염 유도 후 7일째에 이산화탄소(CO₂) 흡입 후 경추 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 전기 가위로 무릎의 털을 제거하고 외과 적 절차로 무릎을 절제합니다.
   2. 뭉툭한 가위로 뒷다리를 절개하여 다리의 피부를 제거하고 허벅지를 가로 질러 발목까지 피부를 자릅니다. 다리와 발의 피부를 부드럽게 벗겨 근육을 드러냅니다. 무릎 관절을 손상시키지 않고 다리에서 근육을 조심스럽게 제거하십시오.
      1. 골반/고관절 바로 위의 뒷다리를 자르고 날카로운 절개 가위를 사용하여 경골을 자릅니다.
   3. 48 시간 동안 4 % 포르말린으로 무릎을 고정하십시오. 2.5 M 포름산을 사용하여 무릎을 석회화하십시오. 3 분 동안 크실렌으로 세 번 헹구고, 100 % 에탄올로 두 번 헹구고, 95 % 에탄올로 두 번 헹구고, 2 분 동안 탈 이온수로 두 번 헹구고, 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)에서 석회질 제거하십시오. 비등 이하의 온도(90°C)에서 20분 동안 처리합니다.
   4. 양쪽 무릎을 제거하고 10% 포르말린으로 고정한 다음 Formical-4에서 석회화합니다. 조직을 파라핀에 삽입하고 4μm로 절편화하고 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 또는 사프라닌 O 염색으로 염색하고 현미경으로 관찰합니다.

결과

그림 1: Ag 특이적 iPSC-Tregs의 채택 전달은 마우스의 AIA를 개선합니다. 쥐 iPSC는 레트로바이러스 구축물 MiDR, MiDR-FoxP3 또는 MiDR-TCR-FoxP3로 형질주입하고 OP9-DL1/DL4/I-A^b 세포에서 공동 배양했습니다. 7일째에, 유전자 형질도입된 세포(3 × 10⁶/마우스)를 세포 이식 2주 후에 AIA로 유도된 암컷 C57BL/6 마우스로 양양적으로 전달하였다. 관절염 유도 다음 날, 관절염 중증도는 무릎 직경을 측정하여 모니터링했습니다. (에이씨) 무릎 직경의 증가율. 무릎 직경의 증가는 0일차에 주사 전에 각 마우스에 대한 주입 전 무릎 직경을 기준으로 계산되었습니다. 관절염...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6j 마우스	잭슨 연구소	664
α-MEM	인비트로젠	A10490-01
FBS(증권 시세	하이클론	SH3007.01
폴리브레네	시그마	107689
진재머	통합 과학	제204130
mFlt-3L	페프로텍	250-31L
미IL-7	페프로텍	217-17
엠BSA	시그마	A7906
난자 알부민	아반토르	제0440-01
증권 시세	디프코	2017014
Tailveiner 구속기	브레인트리 사이언티픽	RTV 150-STD
파라포름알데히드	시그마	P6148-500G	주의: 알레르기 성, 발암 성, 유독

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