종양 특이적 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하기 위한 생체 외 기술

초록

출처: Riccione, K., et al. 교모세포종 표준 치료의 맥락에서 입양 치료를 위한 CAR T 세포 생성. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 종양 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 생체 외 생성 기술을 보여줍니다. 형질전환 RNA를 운반하는 레트로바이러스 벡터는 인터루킨-2가 보충된 배지에서 비장 세포와 혼합되어 T 세포의 생존과 증식을 촉진합니다. 그런 다음 혼합물을 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅된 플레이트로 옮기고 원심분리하여 바이러스와 세포의 융합을 촉진함으로써 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 종양 항원을 표적으로 하는 표면 결합 CAR을 생산할 수 있도록 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 비장 절제술 및 T 세포 준비

0일차:

1. 10ml의 T 세포 배지(TCM)를 50ml 원뿔형에 붓고 비장 채취를 위해 얼음 위에 놓습니다.
2. CO₂ 질식 및 2차 참수로 적절한 수의 동물 희생: 호흡이 끝날 때까지 그리고 그 후 2분 동안 미국 수의학 협회 지침에 따라 10-30% 케이지 부피/분의 유속으로 CO₂를 받는 케이지에 동물을 넣습니다(동시에 5마리 이상의 동물을 희생할 수 없음). CO₂ 챔버에서 동물을 제거하고 목을 베십시오.
   메모: 생후 6-12주 된 암컷 C57BL/6 마우스의 비장 하나에서 약 4.5-5 x 10⁷개의 비장세포가 생성됩니다. 여기서, 약 200 x 10⁶ 세포에 대해 4 개의 비장을 수확합니다.
3. 마우스의 오른쪽이 위를 향하도록 눕히고 70% 에탄올을 분사합니다. 집게로 왼쪽 흉곽 아래의 얇은 주름을 잡고 가위로 약간 절개합니다. 피부를 벗겨내고 집게로 복막의 얇은 주름을 조심스럽게 잡고 작은 구멍을 자릅니다.
4. 비장은 납작한 콩을 닮은 작고 길쭉한 짙은 붉은색 기관으로, 집게와 절제구로 비장을 섬세하게 잡고 주변의 결합 조직을 잘라냅니다. 절제된 비장을 얼음 위에 TCM 10ml가 들어 있는 원뿔형 비장에 넣습니다.
5. 70μm 메쉬 셀 스트레이너 위에 비장을 붓고 5ml 주사기 내부의 뭉툭한 끝으로 으깨서 분해하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 메쉬 스트레이너당 최대 2개의 비장이 분리되어야 합니다.
6. 소량의 TCM을 사용하여 분해 후 스트레이너를 조심스럽게 세척하여 남아 있는 비장 세포를 수집합니다. 분리된 모든 비장을 단일 세포 현탁액으로 모읍니다. TCM으로 최종 부피를 50ml로 가져와 한 번 세척하고 300 x g에서 10분 동안 회전시킵니다.
7. 45ml의 멸균수에 5ml 10x 용해 완충액을 첨가하여 1x 용해 완충액 용액을 준비합니다. 적혈구를 제거하려면, 50ml 원뿔형의 비장당 1x 용해 완충액 5ml에 펠릿을 재현탁하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 잘 섞습니다. 비장이 5개를 초과하는 경우 250ml 원심분리기 튜브를 사용하십시오. 원추형 또는 원심분리기 튜브를 37°C 수조에 5분 동안 놓습니다.
8. 수조에서 용해 반응을 제거하고 용해 완충액과 1:1 비율로 TCM을 첨가하여 반응을 중화합니다. 300 x g에서 10분 동안 회전하여 세탁합니다.
9. 상층액을 흡입하고 위아래로 피펫팅하여 TCM(2ml/비장, 4개의 비장에 대해 총 8ml)에 펠릿을 완전히 재현탁합니다.
10. 190μl 트리판 블루(1:20 희석)에 10μl의 세포 현탁액을 첨가하여 세포 수를 계산합니다. 4개의 격자 사각형 중 하나에서 얻은 숫자에 20 x 10⁴ x 총 부피(8ml)를 곱하여 총 세포 수(예: 125 세포 x 20 x 10⁴ x 8 ml = 200 x 10⁶ 비장 세포)를 구합니다.
11. TCM에서 세포를 2 x 10⁶ cells/ml의 농도로 희석하고 2 μg/ml concanavalin A(ConA) 및 50 IU/ml 재조합 인간 인터루킨-2(rhIL-2)를 보충합니다. 따라서 200 x 10⁶ 비장세포의 경우 8ml 세포, 200μg ConA 및 5,000IU rhIL-2에 92ml 배지를 추가합니다.
12. 24웰 조직 배양 처리된 플레이트의 각 웰에 2mL 세포를 추가하여 각 웰에 4 x 10⁶개의 세포가 있도록 합니다(예: 100ml의 세포에는 약 4개의 플레이트가 필요함).
13. 37 ° C에서 5 % CO₂로 밤새 배양하십시오.

2. 변환

1일차:

1. 채취한 비장 수에 2를 곱하여 transduction에 필요한 비조직 배양 처리된 24-well plate의 수를 계산합니다(4개의 비장에 8개의 plate가 필요함).
2. 다음으로, (총 웰 수 + 3) x 0.5ml(8개 플레이트 x 24 웰 = 192 + 3 = 195) x 0.5 ml = 97.5ml를 곱하여 플레이트를 코팅하는 데 필요한 재조합 인간 피브로넥틴 단편(RHFF) 용액의 부피를 계산합니다.
3. 총 부피에 25 μg(97.5 x 25 = 2437.5 μg)을 곱하여 RHFF를 25 μg/ml 농도로 함유한 97.5 ml 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다. 이 양의 RHFF를 97.5ml PBS에 추가합니다.
4. 웰당 0.5ml PBS/RHFF 용액을 첨가하여 비조직 배양 처리된 24웰 플레이트를 코팅합니다.
5. 4 °C에서 밤새 배양하십시오.

2일차:

1. 비조직 배양 처리된 24웰 플레이트에서 PBS/RHFF 용액을 덤프합니다.
2. PBS에 1ml/well 2% 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
3. 플레이트를 단단히 뒤집어 BSA를 제거합니다. PBS 2ml를 첨가하여 씻으십시오.
4. 각 인간 배아 신장 293T(HEK293T)-폴리-D-라이신(PDL) 코팅 플레이트의 배지를 250ml 원심분리 튜브로 옮기고 500 x g에서 10분 동안 회전시켜 바이러스 상층액을 수집합니다.
5. 바이러스 상층액을 새로운 250ml 원심분리기 튜브에 조심스럽게 옮기되, 형성되었을 수 있는 세포 펠릿을 방해하지 않도록 합니다.
6. 바이러스 상등액에 새로운 TCM을 첨가하여 최종 부피가 RHFF 코팅 웰에 필요한 양보다 3ml 더 많도록 합니다. 예를 들어, 192개의 RHFF 코팅 웰의 경우 바이러스 상층액의 부피를 192 + 3 ml = 195 ml로 가져옵니다.
7. 배양기에서 배양된 비장세포를 제거하고 각 웰에서 2 - 3회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 다시 현탁시킵니다. 250ml 원뿔형으로 옮깁니다. 멀티채널 파이펫을 사용하는 경우 이송 전에 멸균 저장소를 사용하면 이 단계를 신속하게 처리하는 데 도움이 됩니다. 앞서 설명한 대로 계산하고 300 x g에서 10분 동안 회전합니다.
8. 재조합 인간 인터루킨-2(rhIL-2)를 50 IU/ml의 농도로 바이러스 상등액에 첨가합니다. 예를 들어, 50 x 195 = 9,750 IU rhIL-2를 195ml의 바이러스 상등액에 추가합니다.
9. 바이러스 상등액의 비장세포를 1 x 10⁶ cells/ml로 재현탁
10. RHFF 코팅된 24웰 플레이트에 1ml/웰의 비장세포 현탁액을 추가합니다.
11. 다음 설정에 따라 90분 동안 회전: 770 x g, 가속 = 4, 브레이크/감속 = 0, 32°C.
12. 50 IU/ml rhIL-2로 TCM 용액을 준비합니다. 예를 들어, 10,000IU rhIL-2를 추가하여 200TCM 용액을 준비합니다. 원심분리 후 각 웰에 rhIL-2/TCM 1ml를 추가합니다.
13. 37 °C에서 하룻밤 동안 문화 5 % CO₂.

3. CAR T 세포 배양 및 수확

3일차 및 4일차:

1. T 세포가 >80%의 합류를 달성하면 세포가 분열될 수 있습니다(이는 일반적으로 3일차 또는 4일차에 발생함). 세포를 분할하려면 각 웰에서 2-3회 위아래로 부드럽게 파이펫을 주입하고 각 웰에서 1ml를 새로운 24웰 조직 배양 처리된 플레이트의 새 웰로 이동합니다. 그런 다음 모든 웰에서 최종 부피가 2ml가 되도록 각 웰에 50IU/ml IL-2가 포함된 새로운 TCM 1ml를 추가합니다.
2. 세포가 >80% confluence에 도달하지 않으면 각 웰 상단에서 1ml의 배지를 천천히 피펫팅하여 절반 배지 교체를 수행합니다. 매체를 제거하는 동안 바닥에 가라앉은 세포를 방해하지 마십시오. 50 IU/ml rhIL-2를 함유한 신선한 TCM 1 ml를 추가합니다.

5일차:

1. 각 웰에서 3회씩 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 CAR T 세포를 재현탁시키고 250ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 300 x g에서 10분 동안 세포를 회전시킵니다.
2. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 완전히 흡입합니다. PBS로 한 번 세척하고, 앞에서 설명한 대로 세포 수를 세고, PBS로 두 번 세척합니다. 일반적인 CAR T 세포 수율은 웰당 약 1 x 10⁶개 세포(8 플레이트 x 24 웰 = 192 x 10⁶ CAR T 세포)입니다.
3. 200 μg의 부피로 1 x 10⁷을 주입하기 위해 5 x 10⁷/ml의 농도로 PBS에 세포를 재현탁합니다(예: 192 x 10⁶ CAR T 세포의 경우, 세척된 펠릿을 3.84 ml PBS에 재현탁).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
콘카나발린 A	시그마 알드리치	2010	T 세포 증식 및 바이러스 전달을 유도하는 비특이적 유사분열
RPMI 1640	생명 기술	11875-093	T 세포 배양 배지
소 혈청 알부민(BSA), 분획 V—표준 등급	Gemini Bio 제품	700-100피	레트로넥틴 코팅된 플레이트에 대한 레트로바이러스의 비특이적 결합을 차단합니다.
Pharm Lyse (10X 농축액)	BD 바이오사이언스	555899	비장 세포 처리 중 적혈구 용해
70μm 멸균 세포 스트레이너	코 닝	352350	비장세포 처리 중 큰 조직 입자를 걸러냅니다
100mm BioCoat 배양 접시 Poly-D-Lysine	코 닝	356469	HEK293 세포 부착을 촉진하여 transfection 후 증식을 극대화합니다
디메틸 설폭 사이드	시그마 생명과학	D2650	temozolomide의 완전한 용해에 필요
생리	호스피라	메신저 0132 (5/04)	테모졸로마이드 및 케타민/자일라진용 용제
케타테시아 HCl	Henry Schein 동물 건강	제11695-0701-1	케타민 용액
아나세드	로이드 Inc	해당 사항 없음	자일라진 멸균 용액 100mg/mL

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