검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 세포독성 효과기 T 림프구의 비특이적 확장
- 35 Gy에서 공급세포를 준비하고 조사합니다. 2 x 105 - 4 x 105 effector cell의 자극을 위해 3개의 뚜렷한 건강한 donor로부터 10 x 106 peripheral-blood mononuclear cells (PBMC) 및 1 x 106 B-lymphoblastoid cell line (BLCLs)을 준비합니다.
- 10% 열 비활성화 태아 송아지 혈청(FCS), 2mM L-글루타민, 페니실린(100 IU/mL) 및 스트렙토마이신(0.1 μg/mL) 및 300 IU/mL 재조합 인터루킨-2(IL-2)가 보충된 15mL의 Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI)에 공급세포와 효과기 세포를 모두 재현탁합니다.
- 최종 농도 1μg/mL에서 파이토헤마글루티닌(PHA-L)을 추가하고, 조심스럽게 혼합한 후 96웰 U-바닥 플레이트에 웰당 150μL의 세포 현탁액을 분배합니다.
- 가습 된 분위기에서 37 ° C와 5 % CO2로 배양하십시오.
- 배양 웰에 큰 세포 덩어리가 형성될 때까지 매일 플레이트를 확인합니다(~7일차).
- 신선한 배양 배지에서 1 x 106 cells/mL의 배양 플라스크로 세포를 옮깁니다.
- 카운팅(주당 2회)을 통해 총 세포 수를 측정하고 신선한 배양 배지에서 1 x 106 cells/mL로 유지합니다.
메모: 효과기 면역 세포는 휴지 상태(보통 초기 증폭 자극 후 3주)에서 치료 투여를 받을 준비가 되어 있어야 합니다. 이러한 effector cell의 순도와 반응성은 in vivo 주입 전에 확인해야 합니다(예: in vitro assay).
2. 수술 전 이펙터 세포 준비
- 효과기 세포 수를 확인한 후 원심분리(300 x g에서 5분 동안)로 50mL 튜브에 효과기 세포를 수집합니다.
메모: 손실을 보상하려면 과도한 셀(예: 50 x 106)을 준비합니다.
- 상등액을 조심스럽게 제거하고 15mL의 멸균 PBS에 세포를 재현탁시키고 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세척을 수행합니다.
- 상등액을 신중하고 완전하게 제거한 다음 1mL의 멸균 PBS에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 재부유 세포를 1.5mL 마이크로튜브에 옮겨 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 천천히 피펫팅하여 상층액을 조심스럽게 완전히 제거합니다.
- 세포 펠릿을 마우스당 8μL의 멸균 PBS에 재현탁합니다.
메모: 이것은 중요한 단계입니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 세포 현탁액의 부피를 측정합니다. 필요한 경우 멸균 PBS(투여량당 15μL의 PBS에 20 x 106개 세포)를 추가하고 조심스럽게 혼합합니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 마우스당 최종 부피가 15 - 20 μL(반드시 20 μL< 측정)인지 확인합니다.
- 정위 주입이 될 때까지 세포를 얼음 위에 두십시오.
메모: 3시간 이상의 시점은 테스트되지 않았습니다.
3. 정위 주입
- 장비 설정
- 두개내 주사의 정확성(예: 주사기 크기, 원하는 부피 및 주사 속도)을 보장하기 위해 제조업체의 지침에 따라 소동물 정위 프레임을 조립하고 보정합니다.
메모: 느린 주입 속도가 권장됩니다(즉, 2 - 3 μL/분).
- 미생물 안전 캐비닛(MSC) 아래에 재료를 설치하여 기기의 멸균 상태를 유지하고 마우스가 감염되지 않도록 보호합니다.
메모: "등온 블록"을 37 °C의 수조에 놓습니다. 이 시스템은 수술 중 생쥐의 저체온증을 제한합니다. 시술 후 관리에 필요한 발열 패드는 지속적인 온도 모니터링 중에 사용해야 합니다.
- 수술 전 동물 준비
- 마우스 체중의 10μL/g에서 케타민(10mg/mL)과 자일라진(0.1mg/mL)을 복강내 주사로 마우스
에 마취합니다.
- 동물의 완전한 마취 및 진통제를 확인하기 위해 발가락 꼬집음 테스트를 수행합니다.
메모: 모든 움직임은 깊은 진통이 없다는 표시이며, 그런 경우 작업을 반복하기 전에 몇 분이 더 필요합니다.
- 마우스가 제대로 마취되면 가위를 사용하여 수술 부위(두 귀 사이, 코까지)의 털을 제거합니다.
- 수술 전 세포 준비
- 세포가 뭉치는 것을 방지하기 위해 각 주입 전에 피펫으로(여러 번) 세포를 조심스럽게 재현탁합니다.
- 기포 흡입을 방지하기 위해 필요한 세포 현탁액(15 - 20 μL)을 22-G 마이크로 주사기로 조심스럽게 끌어옵니다.
메모: 마이크로주사기에 대한 이 세포 로딩 단계는 주입된 부피의 차이를 최소화하는 데 중요합니다. 시술 사이에 각 개별 주입에 대해 세포를 재장전하여 세포 응집을 방지하고 코호트에서 균일한 수의 effector 세포 투여를 보장합니다.
- 그런 다음 주사기를 개조된 주사기 펌프에 넣습니다.
- 절차적 관리
- 포비돈-요오드 5% 용액에 적신 면봉으로 수술 부위를 최소 3회 소독합니다.
- 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 쥐의 눈에 윤활 안과 연고를 바르십시오.
- 마취된 마우스를 멸균 플라스틱 랩으로 덮인 따뜻한 등온 블록에 정위 프레임에 놓고 수술 중 마우스의 온도를 유지하고 사망률을 제한합니다.
메모: 시술 중 적절한 호흡 흐름을 보장하기 위해 마우스의 코와 이빨은 이빨 바 위에 적절하게 위치해야 합니다.
- 마우스가 치아 막대 위에 위치하면 마우스의 귀 아래에 이어바를 단단히 조여 머리를 고정시킵니다.
메모: 고막을 손상시키거나 호흡을 손상시키지 않도록 주의하십시오.
- 멸균 가위로 두개골 상부를 따라 전방에서 후방으로 1 - 2cm의 정중선 시상 피부를 절개하여 두개골을 노출시킵니다.
- 주사 전에 정위 국소화를 위한 랜드마크 역할을 하기 위해 시상 봉합사와 관상 봉합사(Bregma)의 교차점을 식별합니다(그림 1 참조).
- 이 지점 위에 마이크로 주사기를 놓습니다.
- 마이크로 주사기를 브레그마의 오른쪽 측면 2mm, 전방 0.5mm로 이동합니다.
- 마이크로 드릴을 사용하여 미리 결정된 좌표에서 멸균 드릴 비트로 두개골에 작은 구멍을 만듭니다. 뇌의 외상성 손상을 피하기 위해 피상적인 상태를 유지하도록 주의하십시오.
메모: 이 프로토콜에서는 확립된 종양 내에 면역 세포를 주입했습니다(종양 세포 주입 후 1주일). 피부를 다시 열어야 하며(흉터) 종양 세포 이식에 사용된 것과 동일한 좌표에서 주사를 수행합니다(구멍은 일반적으로 주사 후 최대 2주까지 여전히 존재함). 뇌 실질(brain parenchyma)에 종양(tumor)과 효과기(effector) 세포를 주입하기 위한 좌표가 선택되었다.
- 면역효과세포(Immune effector cell) 주입
- 뚫린 구멍에 마이크로 주사기를 조심스럽게 삽입하고 천천히 움직여 경막에서 바늘을 3mm 앞으로 내민 다음 0.5mm 뒤로 0.5mm 후진하여 최종 깊이 2.5mm를 주입한 후 이펙터 세포를 주입합니다.
- 2 - 3 μL/min의 속도로 effector cell injection을 실행하고 주입 시간 내내 마우스를 모니터링합니다.
- 주입이 완료되면 바늘을 1mm만 빼내고 마이크로 주사기를 1분 더 제자리에 유지한 후 주입 부위에서 누출을 방지하기 위해 마이크로 주사기를 천천히 완전히 빼냅니다.
메모: 정위 장치에서 동물을 제거한 후 향후 실험을 위해 주입 장비를 즉시 청소하십시오.
- 수술 후 관리 및 마우스 추적 관찰
- 정위 프레임에서 동물을 제거하고 즉시 절개 부위에 포비돈 요오드 5% 용액을 바르고 적절한 외과 봉합사로 피부를 봉합합니다.
- 2% 리도카인 젤을 상처에 직접 바르고 시술 후 진통제를 위해 피하 주사로 0.15μg/g의 부프레노르핀을 투여합니다.
- 적절한 마우스 체온을 유지하고 저체온증을 방지하기 위해 마취된 마우스를 37°C로 설정된 가열 패드 위의 케이지에 다시 놓습니다.
메모: 별도의 하우징은 필요하지 않습니다.
- 마우스가 마취에서 완전히 회복될 때까지 모니터링하고 수용실로 옮깁니다.
메모: 현재까지 이 프로토콜은 예상치 못한 합병증이 거의 발생하지 않았기 때문에(주사된 마우스의 5% <) 잘 지원되고 있습니다.
- 매일 생쥐를 모니터링하고 건강 저하 징후(예: 구부정한 자세, 이동성 감소, 엎드린 자세 또는 현저한 체중 감소[≥ 15%])가 관찰되면 안락사시킵니다.
