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1. CART19 셀 생산
- T-세포 분리, 자극 및 체외 배양
- 모든 세포 배양 작업은 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 세포 배양 후드에서 수행합니다. 성분채집술 중에 수집된 비식별화된 정상 기증자 혈액 원추세포에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 채취합니다. 이는 PBMC의 실행 가능한 공급원으로 알려져 있습니다.
- PBMC를 분리하려면 15mL의 밀도 구배 배지를 50mL 밀도 구배 분리 튜브에 추가합니다. 세포 포획을 방지하기 위해 2% 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 동일한 부피의 인산염 완충 식염수(PBS)로 기증자의 혈액을 희석합니다.
- 원뿔에서 희석된 기증자 혈액을 분리 튜브에 첨가하되 혈액과 밀도 구배 매체 사이의 계면을 방해하지 않도록 주의하십시오. 1,200 x g의 원심분리기, RT에서 10분간 원심분리기.
- 상층액을 새로운 50mL 원뿔형으로 디캔팅하고, 최대 40mL를 가져와 PBS + 2% FBS로 세척하고, RT에서 8분 동안 300 x g에서 원심분리하고, 상등액을 흡인하고, 40mL의 완충액에 재현탁하고, 세포 계수를 계산합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 완전 자동화된 세포 분리기를 사용하여 음성 선택 마그네틱 비드 키트를 통해 PBMC에서 T 세포를 분리합니다.
- 분리된 T 세포를 배양하기 위해 10% 인간 AB 혈청(v/v), 1% 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(v/v) 및 무혈원 조혈 세포 배지로 구성된 T 세포 배지(TCM)를 준비합니다. 0.45μm 멸균 진공 필터를 통해 여과한 다음 0.22μm 멸균 진공 필터로 여과하여 매체를 살균합니다.
- 0일차(T 세포 자극 당일)에 T 세포를 자극하기 전에 CD3/CD28 비드를 세척합니다. 세척하려면 필요한 양의 구슬을 놓습니다(3:1 구슬:T 세포의 비율로 충분한 CD3/CD28 구슬 사용; 참고: 비드의 농도는 가변적일 수 있음) 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에서 1mL의 TCM에 재현탁합니다.
- 자석과 접촉하게 하십시오.
- 1분 후 TCM을 흡인하고 1mL의 새 TCM에 재현탁하여 비드를 세척합니다.
- 이 절차를 반복하여 총 3회 세탁합니다.
- 세 번째 세척 후 1mL의 TCM에 비드를 재현탁합니다.
- T 세포를 세십시오.
- 비드를 3:1 beads:cells의 비율로 T cell로 전달합니다.
- 세포를 1 x 106 cells/mL의 최종 농도로 희석합니다.
- 37 ° C, 5 % CO2에서 24 시간 동안 배양합니다.
- T 세포 형질주입 및 형질주입
- 세포 배양 후드, 개인 보호 장비, 폐기 전 사용한 재료를 표백제로 소독하는 것을 포함한 BSL-2+ 예방 조치를 사용하여 렌티바이러스 작업을 수행합니다.
- 렌티바이러스 벡터에서 키메라 항원 수용체-T19(CART19) 구조를 획득합니다.
메모: 여기에 사용된 CART19 구조체는 상업적으로 이용 가능한 단백질 합성 공급업체를 사용하여 설계 및 합성된 후 새로운 방식으로 합성되었습니다. CAR 구조체는 이후 EF-1α 프로모터의 제어 하에 3세대 렌티바이러스로 복제되었습니다. 단일 사슬 가변 영역 단편은 FMC63 클론에서 파생되며 인간 CD19를 인식합니다. CAR19 구조체는 2세대 4-1BB 공동 자극 도메인과 CD3ζ 자극(FMC63-41BBz)을 가지고 있습니다.
- 앞서 설명한 대로 렌티바이러스 생산을 수행합니다.
- 간단히 말해서, 렌티바이러스를 생산하려면 70-90% 밀도에 도달한 293T 세포를 활용해야 합니다.
- 293T 세포에 추가하기 전에 관심 렌티바이러스 플라스미드 15μg, gag/pol/tat/rev 패키징 벡터 18μg, VSV-G 엔벨로프 벡터 7μg, 사전 착화 시약 111μL, 트랜스펙션 시약 129μL 및 트랜스펙션 배지 9.0mL를 포함한 트랜스펙션 시약을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 형질주입된 세포를 37°C, 5%CO2에서 배양합니다.
- 수확, 원심분리기(900 x g에서 10분), 필터(0.45μM 나일론 필터) 및 24시간 및 48시간에서 13,028 x g(18시간 동안) 또는 112,700 x g(2시간 동안)의 초원심분리로 상층액을 농축합니다.
- 나중에 사용할 수 있도록 -80 °C에서 동결하십시오.
- 1일차에 T 세포를 부드럽게 재현탁시켜 0일차에 1 x 106/mL로 자극된 T 세포의 장미를 분해합니다.
- 모든 렌티바이러스 작업에 대한 적절한 BSL-2+ 예방 조치에 따라 자극된 T 세포에 3.0의 감염 다중성(MOI)으로 수확된 신선 또는 냉동 바이러스를 첨가합니다.
- CAR T세포 확장
- 팽창 단계에서 형질도입된 T 세포를 37°C, 5%CO2에서 계속 배양합니다. 3일차와 5일차에 CAR T-세포를 계수하고, 예열된 신선한 TCM을 배양액에 첨가하여 CAR T-세포 농도를 1 x 106/mL로 유지합니다.
- 자극 후 6일(6일차)에 자석을 사용하여 형질도입된 T 세포에서 구슬을 제거합니다. T 세포를 채취하고 재현탁시킨 후 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 자석에 1분 동안 넣습니다. 그런 다음 상층액(CAR T-세포 포함)을 수집하고 비드를 버립니다.
- 수집된 CAR T-세포를 1 x 106 cells/mL의 농도로 배양에 다시 넣어 증식을 재개합니다.
- 6일차에 유세포 분석으로 CAR의 표면 발현을 평가합니다.
메모: CAR의 표면 발현을 검출하기 위해 염소 항-마우스 IgG(H+L) 교차 흡착된 2차 항체로 염색하거나 형광 색소에 접합된 CD19 특이적 펩타이드로 염색하는 등 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 여기서, 배양액에서 부분 표본(약 100,000 T 세포)을 취하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 2% 소 태아 혈청 및 1% 아지드화나트륨으로 준비된 흐름 완충액으로 세척합니다. 항-CAR 항체로 세포를 염색하고 두 번 씻어냅니다. 살아있는/죽은 염색 및 CD3 단클론 항체(OKT3)로 세포를 염색합니다. 세포를 세척하고 플로우 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 형질도입 효율을 결정하기 위해 세포분석기에서 획득합니다.
- CAR T 세포 동결 보존
- 자극 후 8일(T세포 확장 8일차)이 지난 후 CAR T-세포를 수확하고 동결 보존하려면 배양에서 세포를 수확합니다.
- 300 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다.
- 10% 디메틸 설폭사이드와 90% 소 태아 혈청으로 구성된 동결 배지에서 바이알당 mL당 1,000만 개의 세포로 동결 배지에 재현탁합니다.
- -80 °C 냉동고에서 -1 °C/min의 냉각 속도를 달성하기 위해 냉동 용기에서 동결한 다음 48시간 후에 액체 질소로 옮깁니다.
- 시험관 내 또는 생체 내 실험에 사용하기 전에 CAR T 세포를 따뜻한 TCM에서 해동합니다.
- 세포를 세척하여 희석하고 디메틸 설폭사이드를 제거하고 따뜻한 TCM에서 2 x 106 cells/mL의 농도로 재현탁합니다. 37 ° C, 5 % CO2에서 밤새 휴식을 취하십시오.
2. 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF k/o) CART19 생산
- GM-CSF를 방해하기 위해 인간 사이토카인 GM-CSF를 암호화하는 CSF2 유전자에 대해 높은 효율을 가진 것으로 이전에 보고된 스크리닝 gRNA를 통해 선택된 인간 GM-CSF(CSF2)의 엑손 3을 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA)를 활용<>
메모: 이 gRNA(U6 promoter 아래)를 포함하는 상업적으로 합성된 연구 등급 Cas9 3세대 렌티바이러스 구조체가 사용되었습니다. 이 구조체는 퓨로마이신 저항성 유전자를 포함하고 있습니다. gRNA의 염기서열은 GACCTGCCTACAGACCCGCC입니다.
- 렌티바이러스를 생산하려면 70-90% 밀도에 도달한 293T 세포를 활용합니다.
- 관심 렌티바이러스 플라스미드 15μg, gag/pol/tat/rev 패키징 벡터 18μg, VSV-G 엔벨로프 벡터 7μg, 사전 착화 시약 111μL, 트랜스펙션 시약 129μL 및 트랜스펙션 배지 9.0mL를 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 293T 세포에 transfection 시약을 추가합니다. 37 °C에서 배양, 5 % 이산화탄소 (CO2 ).
- 수확, 원심분리기(900 x g 10분), 필터(0.45 μM 나일론 필터) 및 농축 상등액을 18시간 동안 13,028 x g 또는 112,700 x g에서 초원심분리하여 24시간 및 48시간에 농축하고 향후 사용을 위해 -80 °C에서 동결합니다.
- 1일차에 T 세포를 부드럽게 재현탁시켜 로제트를 분해합니다.
- BSL-2+ 승인 실험실에서 동결 또는 갓 채취한 바이러스를 자극된 T 세포에 첨가하여 CAR T 세포를 생성합니다. CRISPR 렌티바이러스를 표적으로 하는 CAR19 렌티바이러스와 GM-CSF로 T 세포를 형질전환 합니다. CAR19 렌티바이러스를 MOI 3으로 추가합니다. CRISPR 렌티바이러스의 적정은 불가능했기 때문에 15 ug 플라스미드 제제에서 생성된 바이러스 입자를 사용하여 10 x 106 T 세포를 형질주입합니다.
- 1단계에서 논의한 대로 T-세포 자극, 증식 및 동결 보존의 나머지 단계를 참조하십시오.
- 퓨로마이신 내성을 가진 lentiCRISPR 편집 T 세포의 경우, 3일차와 5일차에 1mL당 1μg의 퓨로마이신 농도로 세포를 퓨로마이신 디하이드로클로라이드로 치료합니다.