CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 CAR T 세포의 유전자 변형

초록

출처: Sterner, R. M. et al., CRISPR/Cas9를 사용하여 CAR-T 세포에서 GM-CSF를 녹아웃.J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 CRISPR-Cas9 시스템을 통해 유전자 변형 CAR T 세포를 만드는 과정을 간략하게 설명합니다. T 세포를 CRISPR과 CAR 렌티바이러스에 감염시키면 표적 유전자가 변형되고 키메라 항원 수용체(CAR)가 합성되어 궁극적으로 유전적으로 변형된 CAR T 세포가 형성됩니다.

프로토콜

1. CART19 셀 생산

1. T-세포 분리, 자극 및 체외 배양
   1. 모든 세포 배양 작업은 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 세포 배양 후드에서 수행합니다. 성분채집술 중에 수집된 비식별화된 정상 기증자 혈액 원추세포에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 채취합니다. 이는 PBMC의 실행 가능한 공급원으로 알려져 있습니다.
   2. PBMC를 분리하려면 15mL의 밀도 구배 배지를 50mL 밀도 구배 분리 튜브에 추가합니다. 세포 포획을 방지하기 위해 2% 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 동일한 부피의 인산염 완충 식염수(PBS)로 기증자의 혈액을 희석합니다.
      1. 원뿔에서 희석된 기증자 혈액을 분리 튜브에 첨가하되 혈액과 밀도 구배 매체 사이의 계면을 방해하지 않도록 주의하십시오. 1,200 x g의 원심분리기, RT에서 10분간 원심분리기.
      2. 상층액을 새로운 50mL 원뿔형으로 디캔팅하고, 최대 40mL를 가져와 PBS + 2% FBS로 세척하고, RT에서 8분 동안 300 x g에서 원심분리하고, 상등액을 흡인하고, 40mL의 완충액에 재현탁하고, 세포 계수를 계산합니다.
   3. 제조업체의 프로토콜에 따라 완전 자동화된 세포 분리기를 사용하여 음성 선택 마그네틱 비드 키트를 통해 PBMC에서 T 세포를 분리합니다.
   4. 분리된 T 세포를 배양하기 위해 10% 인간 AB 혈청(v/v), 1% 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(v/v) 및 무혈원 조혈 세포 배지로 구성된 T 세포 배지(TCM)를 준비합니다. 0.45μm 멸균 진공 필터를 통해 여과한 다음 0.22μm 멸균 진공 필터로 여과하여 매체를 살균합니다.
   5. 0일차(T 세포 자극 당일)에 T 세포를 자극하기 전에 CD3/CD28 비드를 세척합니다. 세척하려면 필요한 양의 구슬을 놓습니다(3:1 구슬:T 세포의 비율로 충분한 CD3/CD28 구슬 사용; 참고: 비드의 농도는 가변적일 수 있음) 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에서 1mL의 TCM에 재현탁합니다.
   6. 자석과 접촉하게 하십시오.
   7. 1분 후 TCM을 흡인하고 1mL의 새 TCM에 재현탁하여 비드를 세척합니다.
   8. 이 절차를 반복하여 총 3회 세탁합니다.
   9. 세 번째 세척 후 1mL의 TCM에 비드를 재현탁합니다.
   10. T 세포를 세십시오.
   11. 비드를 3:1 beads:cells의 비율로 T cell로 전달합니다.
   12. 세포를 1 x 10⁶ cells/mL의 최종 농도로 희석합니다.
   13. 37 ° C, 5 % CO₂에서 24 시간 동안 배양합니다.
2. T 세포 형질주입 및 형질주입
   1. 세포 배양 후드, 개인 보호 장비, 폐기 전 사용한 재료를 표백제로 소독하는 것을 포함한 BSL-2+ 예방 조치를 사용하여 렌티바이러스 작업을 수행합니다.
   2. 렌티바이러스 벡터에서 키메라 항원 수용체-T19(CART19) 구조를 획득합니다.
      메모: 여기에 사용된 CART19 구조체는 상업적으로 이용 가능한 단백질 합성 공급업체를 사용하여 설계 및 합성된 후 새로운 방식으로 합성되었습니다. CAR 구조체는 이후 EF-1α 프로모터의 제어 하에 3세대 렌티바이러스로 복제되었습니다. 단일 사슬 가변 영역 단편은 FMC63 클론에서 파생되며 인간 CD19를 인식합니다. CAR19 구조체는 2세대 4-1BB 공동 자극 도메인과 CD3ζ 자극(FMC63-41BBz)을 가지고 있습니다.
   3. 앞서 설명한 대로 렌티바이러스 생산을 수행합니다.
      1. 간단히 말해서, 렌티바이러스를 생산하려면 70-90% 밀도에 도달한 293T 세포를 활용해야 합니다.
      2. 293T 세포에 추가하기 전에 관심 렌티바이러스 플라스미드 15μg, gag/pol/tat/rev 패키징 벡터 18μg, VSV-G 엔벨로프 벡터 7μg, 사전 착화 시약 111μL, 트랜스펙션 시약 129μL 및 트랜스펙션 배지 9.0mL를 포함한 트랜스펙션 시약을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 형질주입된 세포를 37°C, 5%_CO2에서 배양합니다.
      3. 수확, 원심분리기(900 x g에서 10분), 필터(0.45μM 나일론 필터) 및 24시간 및 48시간에서 13,028 x g(18시간 동안) 또는 112,700 x g(2시간 동안)의 초원심분리로 상층액을 농축합니다.
      4. 나중에 사용할 수 있도록 -80 °C에서 동결하십시오.
   4. 1일차에 T 세포를 부드럽게 재현탁시켜 0일차에 1 x 10⁶/mL로 자극된 T 세포의 장미를 분해합니다.
   5. 모든 렌티바이러스 작업에 대한 적절한 BSL-2+ 예방 조치에 따라 자극된 T 세포에 3.0의 감염 다중성(MOI)으로 수확된 신선 또는 냉동 바이러스를 첨가합니다.
3. CAR T세포 확장
   1. 팽창 단계에서 형질도입된 T 세포를 37°C, 5%_CO2에서 계속 배양합니다. 3일차와 5일차에 CAR T-세포를 계수하고, 예열된 신선한 TCM을 배양액에 첨가하여 CAR T-세포 농도를 1 x 10⁶/mL로 유지합니다.
   2. 자극 후 6일(6일차)에 자석을 사용하여 형질도입된 T 세포에서 구슬을 제거합니다. T 세포를 채취하고 재현탁시킨 후 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 자석에 1분 동안 넣습니다. 그런 다음 상층액(CAR T-세포 포함)을 수집하고 비드를 버립니다.
   3. 수집된 CAR T-세포를 1 x 10⁶ cells/mL의 농도로 배양에 다시 넣어 증식을 재개합니다.
   4. 6일차에 유세포 분석으로 CAR의 표면 발현을 평가합니다.
      메모: CAR의 표면 발현을 검출하기 위해 염소 항-마우스 IgG(H+L) 교차 흡착된 2차 항체로 염색하거나 형광 색소에 접합된 CD19 특이적 펩타이드로 염색하는 등 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 여기서, 배양액에서 부분 표본(약 100,000 T 세포)을 취하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 2% 소 태아 혈청 및 1% 아지드화나트륨으로 준비된 흐름 완충액으로 세척합니다. 항-CAR 항체로 세포를 염색하고 두 번 씻어냅니다. 살아있는/죽은 염색 및 CD3 단클론 항체(OKT3)로 세포를 염색합니다. 세포를 세척하고 플로우 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 형질도입 효율을 결정하기 위해 세포분석기에서 획득합니다.
4. CAR T 세포 동결 보존
   1. 자극 후 8일(T세포 확장 8일차)이 지난 후 CAR T-세포를 수확하고 동결 보존하려면 배양에서 세포를 수확합니다.
   2. 300 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다.
   3. 10% 디메틸 설폭사이드와 90% 소 태아 혈청으로 구성된 동결 배지에서 바이알당 mL당 1,000만 개의 세포로 동결 배지에 재현탁합니다.
   4. -80 °C 냉동고에서 -1 °C/min의 냉각 속도를 달성하기 위해 냉동 용기에서 동결한 다음 48시간 후에 액체 질소로 옮깁니다.
   5. 시험관 내 또는 생체 내 실험에 사용하기 전에 CAR T 세포를 따뜻한 TCM에서 해동합니다.
   6. 세포를 세척하여 희석하고 디메틸 설폭사이드를 제거하고 따뜻한 TCM에서 2 x 10⁶ cells/mL의 농도로 재현탁합니다. 37 ° C, 5 % CO₂에서 밤새 휴식을 취하십시오.

2. 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF ^k/o) CART19 생산

1. GM-CSF를 방해하기 위해 인간 사이토카인 GM-CSF를 암호화하는 CSF2 유전자에 대해 높은 효율을 가진 것으로 이전에 보고된 스크리닝 gRNA를 통해 선택된 인간 GM-CSF(CSF2)의 엑손 3을 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA)를 활용<> 메모: 이 gRNA(U6 promoter 아래)를 포함하는 상업적으로 합성된 연구 등급 Cas9 3세대 렌티바이러스 구조체가 사용되었습니다. 이 구조체는 퓨로마이신 저항성 유전자를 포함하고 있습니다. gRNA의 염기서열은 GACCTGCCTACAGACCCGCC입니다.
2. 렌티바이러스를 생산하려면 70-90% 밀도에 도달한 293T 세포를 활용합니다.
3. 관심 렌티바이러스 플라스미드 15μg, gag/pol/tat/rev 패키징 벡터 18μg, VSV-G 엔벨로프 벡터 7μg, 사전 착화 시약 111μL, 트랜스펙션 시약 129μL 및 트랜스펙션 배지 9.0mL를 실온에서 30분 동안 배양합니다.
4. 293T 세포에 transfection 시약을 추가합니다. 37 °C에서 배양, 5 % 이산화탄소 (CO₂ ).
5. 수확, 원심분리기(900 x g 10분), 필터(0.45 μM 나일론 필터) 및 농축 상등액을 18시간 동안 13,028 x g 또는 112,700 x g에서 초원심분리하여 24시간 및 48시간에 농축하고 향후 사용을 위해 -80 °C에서 동결합니다.
6. 1일차에 T 세포를 부드럽게 재현탁시켜 로제트를 분해합니다.
7. BSL-2+ 승인 실험실에서 동결 또는 갓 채취한 바이러스를 자극된 T 세포에 첨가하여 CAR T 세포를 생성합니다. CRISPR 렌티바이러스를 표적으로 하는 CAR19 렌티바이러스와 GM-CSF로 T 세포를 형질전환 합니다. CAR19 렌티바이러스를 MOI 3으로 추가합니다. CRISPR 렌티바이러스의 적정은 불가능했기 때문에 15 ug 플라스미드 제제에서 생성된 바이러스 입자를 사용하여 10 x 10⁶ T 세포를 형질주입합니다.
8. 1단계에서 논의한 대로 T-세포 자극, 증식 및 동결 보존의 나머지 단계를 참조하십시오.
9. 퓨로마이신 내성을 가진 lentiCRISPR 편집 T 세포의 경우, 3일차와 5일차에 1mL당 1μg의 퓨로마이신 농도로 세포를 퓨로마이신 디하이드로클로라이드로 치료합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CD3 단클론항체(OKT3), PE, eBioscience	인비트로젠	Tel.: 12-0037-42
CD3 단클론항체(UCHT1), APC, eBioscience	인비트로젠	Tel.: 17-0038-42
초이스 타크 블루 마스터믹스	덴빌 사이언티픽	C775Y51
CTS(세포 치료 시스템) Dynabeads CD3/CD28	지브코	40203D
CytoFLEX 시스템 B4-R2-V2	벡크만 쿨터	C10343	유세포 분석기
디메틸 설폭사이드	밀리포어 시그마	D2650-100ML
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	지브코	14190-144
Dynabeads MPC-S (자분입자농축기)	어플라이드 바이오시스템즈	A13346
Easy 50 EasySep 자석	스템셀 테크놀로지스	18002
EasySep 인간 T 세포 분리 키트	스템셀 테크놀로지스	17951	네거티브 선택 마그네틱 비드, 17951RF에는 팁과 버퍼가 포함되어 있습니다.
소 태아 세럼	밀리포어 시그마	F8067
FITC 마우스 안티 휴먼 CD107a	BD 파밍겐	555800
정착 매체 (매체 A)	인비트로젠	GAS001S100
GenCRISPR gRNA 구조체: 이름: CSF2	진스크립트	N/A	사용자 정의 순서
CRISPR 가이드 RNA 1; 종 : 인간, 벡터 :
pLentiCRISPR v2; 저항성 : 암피실린; 사본 번호:
높다; 플라스미드 제제: 표준 배송: 4 μg (무료
요금)
염소 안티 마우스 IgG (H + L) 교차 흡착 된 2 차 항체, Alexa Fluor 647	인비트로젠	A-21235
https://tide.nki.nl.	데스크탑 유전학
인간 AB 혈청; 남성 기증자; AB형; 우리	코 닝	35-060-CI
IFN gamma 단클론 항체 (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience	인비트로젠	Tel.: 47-7319-42
Lipofectamine 3000 트랜스펙션 시약	인비트로젠	L3000075
LIVE/DEAD 고정성 Aqua Dead Cell Stain Kit, 405nm 여기용	인비트로젠	L34966
림프렙	스템셀 테크놀로지스	7851
Monensin 솔루션, 1000X	바이오레전드	420701
마우스 안티 휴먼 CD28 클론 CD28.2	BD 파밍겐	559770
마우스 안티 휴먼 CD49d 클론 9F10	BD 파밍겐	561892
마우스 안티 휴먼 MIP-1β PE-Cy7	BD 파밍겐	560687
Mr. Frosty 냉동 용기	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	5100-0001
NALM6, 클론 G5	증권 시세	CRL-3273 (영문	급성 림프모구성 백혈병 세포주
뉴클레아제 무함유 물	프로메가	P119C
Olympus 진공 필터 시스템, 500 mL, PES 멤브레인, 0.22uM, 멸균	제네시 사이언티픽	25-227
Olympus 진공 필터 시스템, 500 mL, PES 멤브레인, 0.45uM, 멸균	제네시 사이언티픽	25-228
Opti-MEM I 리듀스-세럼 미디엄 (1X), 리퀴드	지브코	31985-070
PE-CF594 마우스 안티 휴먼 IL-2	BD 호라이즌	562384
페니실린-스트렙토마이신-글루타민(100X), 액상	지브코	제10378-016
투과화 매체(Medium B)	인비트로젠	GAS002S100
PureLink 게놈 DNA 미니 키트	인비트로젠	K182001
퓨로마이신 디하이드로클로라이드	MP 바이오메디컬, Inc.	210055210
QIAquick 젤 추출 키트	키아젠	28704
쥐 안티 휴먼 GM-CSF BV421	BD 호라이즌	562930
로보셉-S	스템셀 테크놀로지스	21000	완전 자동화된 세포 분리기
셉메이트-50 (IVD)	스템셀 테크놀로지스	85450
아지드화나트륨, 5% (w/v)	리카 케미컬	7144.8-16
X-VIVO 15 무혈청 조혈 세포 배지	론자	04-418큐

년 년 년 년 ) 표시기 ) 년 년 년 호 년 년