T 세포의 유전자 편집을 위한 CRISPR-Cas9 기술

초록

출처: Agarwal, S., et al. 인간 CRISPR 엔지니어링 CAR-T 세포 생산. J. Vis. 특급 (2021).

이 동영상은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 인간 T 세포에서 유전자 편집을 수행하는 방법을 보여줍니다. 1차 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물은 CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체와 결합되어 knockout을 위한 특정 유전자를 표적으로 합니다. 전기천공법(electroporation) 시 sgRNA는 Cas9을 타겟 DNA 염기서열로 유도하여 정밀한 절단을 생성합니다. 그런 다음 이러한 절단은 세포의 비상동 말단 결합 메커니즘에 의해 복구되어 유전자 녹아웃으로 이어집니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 1차 인간 T 세포의 sgRNA 설계 및 유전자 파괴

1. CRISPR sgRNA의
   설계 메모: 여러 서버와 프로그램을 통해 타겟 특이적 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 설계를 용이하게 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no) 및 Broad Institute(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)의 gRNA 디자인 포털을 사용하여 클러스터링된 CRISPR(Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sgRNA를 설계했습니다.
   1. 각 표적 유전자에 대해 6-10개의 sgRNA 염기서열을 설계하여 초기 코딩 엑손 염기서열을 표적으로 합니다.
      참고: sgRNA는 on-target 효능이 높고 off-target 효능이 낮아야 합니다. sgRNA 효능을 결정하기 위한 각 기계 학습 알고리즘은 약간 다르게 작동합니다. 따라서 여러 sgRNA 디자인 도구를 비교하고 스크리닝을 위해 6-10개의 sgRNA 목록을 선별하는 것이 좋습니다.
2. 1차 인간 T 세포의 유전자 파괴
   1. 건강한 자발적 기증자로부터 자가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 얻습니다. 프로토콜의 개략적인 타임라인은 그림 1A에 설명되어 있으며 아래에 설명되어 있습니다.
   2. 시판되는 CD4 및 CD8 selection kit를 사용하여 CD4+ 및 CD8+ T cell을 분리할 수 있습니다.
   3. CD4+ 및 CD8+ T 세포를 1:1 비율로 결합하고 각각 5ng/mL의 인간 인터루킨-7(huIL-7) 및 인간 인터루킨 -15(huIL-15)가 보충된 R10에서^{3x10 6} cells/mL로 밤새 배양합니다. IL-7 및 IL-15는 중추 기억 표현형을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, IL-7 및 IL-15로 증식된 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포는 인터루킨-2(IL-2) 팽창 CAR-T 세포에 비해 우수한 항종양 효능을 가지고 있으므로 첨가하는 것이 좋습니다.
   4. 다음날, T 세포를 계수하고 5분 동안 300 x g에서 5-10 x 10⁶ 세포를 원심분리하십시오. 모든 상층액을 버리고 세포 펠릿을 환원된 혈청 최소 필수 배지로 세척합니다. 제조업체의 지침에 따라 100μL의 핵 펙션 용액에 펠릿을 재현탁합니다(Table of Materials
   ).
   5. 세포를 세척하는 동안 실온(RT)에서 10분 동안 10μg의 Cas9 nuclease와 5μg의 sgRNA를 배양하여 CRISPR 관련 단백질 9(Cas9) 및 gRNA와 함께 ribonucleoprotein(RNP) 복합체를 준비합니다. Cas9와 sgRNA의 몰 비율은 1:2.4입니다. Cas9와 electroporation enhancer를 포함하지만 sgRNA는 포함하지 않는 모의 대조군을 사용하는 것이 좋습니다.
      메모: 이 단계에서 multiplex gene editing은 다음 단계에서 설명하는 바와 같이 각 target에 대해 개별적으로 RNP complex를 만들고 nucleofection 시 세포와 결합하여 수행할 수 있습니다. RNP 복합체를 조립하기 위한 시약을 선택하는 것은 높은 녹아웃(KO) 효율을 얻기 위한 핵심입니다. 예를 들어, 서로 다른 공급업체의 Cas9 nuclease는 다양한 off-target effect를 가지고 있으며, 화학적으로 변형된 gRNA는 T 세포에 대한 독성을 감소시켜 KO 효율을 증가시킵니다.
   6. 1.2.4단계의 재현탁 세포를 1.2.5단계의 RNP 복합체와 결합하고 4.2μL의 4μM 전기천공증 인핸서(인간 게놈과 상동성이 없는 단일 가닥 DNA[ssDNA] 올리고뉴클레오티드)를 추가합니다. 잘 섞어 전기천공법 큐벳에 옮깁니다. 기포는 전기천공(electroporation) 효율을 손상시키므로 피하십시오.
   7. 펄스 코드 EH111을 사용하여 셀을 전기천공합니다. 전기천공법 후, 5 ng/mL huIL-7 및 huIL-15가 보충된 R10의 세포를 30°C에서 48시간 동안 30°C에서 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후 T세포 활성화 및 증식을 진행합니다.

결과

그림 1. 편집된 CAR-T 세포의 확장과 개체군 배가. (A) 1차 인간 CART 세포에서 CRISPR 편집 및 제조 타임라인. (B) CAR-T 세포가 확장되는 동안 Coulter Counter를 사용하여 측정한 Mock 및 CRISPR 편집 CD19 CAR-T 세포의 집단 배가(n=3 healthy donors; KO=녹아웃) (C) CAR-T 세포(n=3 건강한 공여자)가 증식하는 동안 쿨터 계수기를 사용하여 측정한 세포 크기(μm3). (D) 모의 세포와 편집된 CAR-T 세포 모두에서 CAR 발현을 보여주는 여러 공여자의 CAR 염색 및 평균을 보여주는 대표적...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4D-Nucleofactor 코어 유닛	론자	AAF-1002B
4D-핵인자 X-유닛	론자	AAF-1002X
Cas9-Electroporation 인핸서	증권 시세	1075915
CD4+ T 세포 분리 키트	StemCell 기술	15062
CD8+ T 세포 분리 키트	StemCell 기술	15063
코닝 0.45 미크론 진공 필터/병	코 닝	430768
코닝 T150 세포 배양 플라스크	밀리포어 시그마	CLS430825
DNAeasy 혈액 및 조직 키트	키아겐	69504
글루타맥스 보충제	써모피셔	35050061
헤페스 (1M)	써모피셔	15630080
휴일-15	페프로텍	200-15
휴일-7	페프로텍	200-07
리포펙타민 2000	써모피셔	11668019
옵티-MEM	써모피셔	31985062
P3 일차 세포 4D-핵인자 X Kit L	론자	V4XP-3024
페니실린-스트렙토마이신-글루타민	써모피셔	10378016
RPMI1640	써모피셔	12633012
sgRNA (에지RNA)	증권 시세
스파이 파이 Cas9	알데브론	9214

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