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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 마우스 하우징 및 유지 보수
- 6-8주 된 NSG 마우스(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- 온도, 습도 및 압력이 제어되는 실내에 공기 교환, 프리 필터 및 고효율 미립자 공기(HEPA) 필터(0.22μm)를 사용하여 SPF 조건에서 마우스를 수용합니다.
- 프리필터 및 HEPA 필터(0.22μm)로 공기 교환을 관리할 수 있는 랙 시스템의 오토클레이브 개별 마이크로아이솔레이터 케이지에 마우스를 수용하고 유지 관리합니다.
- 70% 에탄올로 전처리된 Class II Type A2 생물 안전 흄 후드에서 마우스의 모든 절차와 조작을 수행합니다. 동물실에서 일하기 전에 샤워를 하고 깨끗한 스크럽, 타이벡 슈트, 부츠 커버, 헤어 캡, 안면 마스크, 장갑으로 갈아입습니다. 수술 중에는 타이벡 슈트 위에 수술 가운을 착용하십시오.
메모: 시술 전에 자외선(UV) 오염 제거도 선호됩니다.
- 가능한 경우 모든 기기와 시약을 고압멸균한 다음 흄 후드로 옮기기 전에 소독하십시오.
- 절차 중에는 랙에서 동물의 개별 환기 케이지를 제거하고 흄 후드로 옮기기 전에 소독하십시오.
- 생쥐에게 방사선 조사된 식단을 먹이고 오토클레이브 물을 제공합니다. 방사선 조사된 음식을 제공하고 필요에 따라 추가로 방사선 조사 식품을 보충합니다. 오토클레이브 물을 매주 또는 필요에 따라 교체하십시오.
메모: 오토클레이브 산성수도 사용할 수 있습니다. 제공된 방사선 조사 사료는 제조 후 6개월의 유통 기한을 가졌습니다.
2. 인간화 된 골수, 간 및 흉선 (BLT) 마우스의 생성
참고: hu-BLT 마우스의 세대는 앞에서 설명했습니다.
- 수술 당일, 생쥐에게 체중의 12 cGy/g의 선량으로 전신 방사선 조사를 실시합니다.
- 수술을 위해 마우스를 준비합니다.
- 방사선 조사를 받은 각 마우스에 100mg/kg의 작업 농도의 케타민과 12mg/kg 농도의 자일라진의 혼합물을 투여하며, 이는 마취를 위한 복강내(IP) 주사에 의한 체중에 따라 마우스당 130-170μL 범위입니다. 케타민과 자일라진 혼합물 3ml를 준비하려면 100mg/mL의 원료 농도에서 0.27mL의 케타민과 100mg/mL 농도의 자일라진 0.03mL를 멸균 식염수 2.7mL에 넣고 잘 섞습니다.주사 전에 70% 이소프로판올로 피부를 소독합니다.
- 방사선 조사를 받은 각 마우스에게 체중 1mg/kg(절반 생, 72시간, SR-LAB)을 피하 주사로 투여하여 오래 지속되는 통증 관리를 위해 제공합니다.
- 수술 전 항생제 예방을 위해 방사선 조사된 각 마우스에 IP 주사로 100μL(858μg)의 세파졸린을 투여합니다.
- 나중에 왼쪽 신장을 노출시키는 데 사용되는 수술 부위에서 마우스의 왼쪽 측면 및 내측 주위에 전기 이발기를 사용하여 마우스의 털을 면도합니다.
- 페달 반사(단단한 발가락 꼬집음)로 적절한 마취 수준을 확인합니다.
- 수술 중 어느 시점에서든 추가 마취가 필요한 경우 3-5%의 이소플루란 가스를 투여합니다.
- 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오. 필요한 경우 귀표를 적용합니다.
- 간과 흉선 조직을 왼쪽 신장 캡슐에 이식하는 수술을 수행합니다.
- 수술 부위 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 원을 그리며 요오드 스크럽을 바르고 수술 부위의 피부를 소독합니다. 70% 이소프로판올로 이 과정을 반복하고 요오드로 세 번째 반복합니다.
- 겸자를 사용하여 먼저 인간 태아 간 조직 조각 하나를 투관침에 넣습니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 하나의 인간 태아 흉선 조직 조각을 투관침에 넣습니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 다른 인간 태아 간 조직 조각을 투관침에 로드합니다. 티슈는 투관침의 내부 치수에 맞게 1-1.6mm3로 절단해야 합니다.
- 집게를 사용하여 피부를 들어 올리고 가위를 사용하여 세로로 작게 자릅니다. 마우스 왼쪽에서 컷을 1.5-2cm로 확장합니다.
- 집게를 사용하여 근육층을 들어 올리고 가위를 사용하여 세로로 작게 자릅니다. 필요에 따라 절단부를 확장하여 신장을 노출시킵니다.
- 신장을 둘러싼 지방 조직을 부드럽게 잡아 신장을 노출시킵니다. 신장 실질을 직접 만지지 마십시오.
- 메스를 사용하여 신장 캡슐의 뒤쪽 끝을 1-2mm 절개합니다.
- 신장의 장축과 평행한 절개를 통해 사전 로드된 투관침을 천천히 삽입하고 신장 캡슐과 신장 사이의 조직을 방출합니다.
- 신장과 장을 조심스럽게 정상 위치로 되돌립니다. 13mm 3/8 원형 바늘이 있는 흡수성 5/0 P-3(P-13) 봉합사를 사용하여 근육층을 닫고 수술용 스테이플을 사용하여 피부를 닫습니다.
- 수술 후 회복을 위해 마우스를 깨끗한 오토클레이브 마이크로아이솔레이터 케이지에 넣습니다.
- 수술 후 회복 중 열 손실을 최소화하려면 물을 데우고 순환시키는 워터 펌프에 연결된 가열 패드에 쥐가 들어 있는 케이지를 놓습니다.
- 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 쥐를 모니터링합니다.
- 수술 완료 후 6시간 이내에 꼬리 정맥을 통해 인간 태아 간 조직에서 분리된 CD34+ 조혈 줄기세포를 주입합니다.
- 열 램프로 쥐를 따뜻하게 하십시오. 꼬리에 70% 이소프로판올을 소독한 후 꼬리 정맥에 1.5-5 × 105 줄기세포/200 μL를 주입합니다.
- 주사로 인한 출혈을 멈추고 마우스를 마이크로 아이솔레이터 케이지로 되돌리고 마이크로 아이솔레이터 케이지를 케이지 랙으로 되돌립니다.
메모: 수술 후 마우스는 일반적으로 회복 중과 회복 후에 마이크로아이솔레이터 케이지당 5마리씩 함께 수용됩니다. 그러나 생쥐는 모두 같은 날 수술을 받은 경우에만 함께 수용됩니다.
- 매일 쥐를 확인하십시오. 수술용 스테이플을 주의 깊게 모니터링하고 필요에 따라 교체하십시오. 감염이나 불편함의 징후가 있는지 쥐를 면밀히 모니터링하십시오. 수술 후 며칠 동안 마이크로아이솔레이터 케이지 바닥에 고압멸균 식품을 공급합니다.
- 수술 후 7-10일 후에 수술용 스테이플을 제거합니다. 생쥐를 마취하기 위해 3-5%의 이소플루란 가스를 투여합니다. 스테이플을 조심스럽게 제거한 다음 항생제와 통증 완화 연고를 해당 부위에 바르십시오.
- 인간 면역 세포의 재구성을 위해 9-12 주를 허용 한 다음 인간화 된 각 마우스의 내측 복재 정맥에서 말초 혈액을 수집합니다.
- 호흡을 위해 마우스 머리 근처에 구멍이 있고 마우스 뒤쪽 근처에 한쪽 다리를 분리하기 위한 구멍이 있는 적절한 크기의 플라스틱 원뿔 지지대를 사용하여 의식이 있는 마우스를 제지합니다.쥐를 먼저 구속 원뿔 머리에 넣은 다음 다리 구멍을 통해 한쪽 다리를 부드럽게 당깁니다.
- 외딴 다리의 내측에 70% 이소프로판올을 뿌린 다음 같은 부위에 항생제와 통증 완화 연고를 펴 바릅니다.
메모: 연고는 제모할 필요 없이 정맥의 위치를 드러내는 데 도움이 되며 혈구 형성에도 도움이 됩니다.
- 90° 각도로 25게이지 바늘을 사용하여 정맥에 구멍을 뚫고 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 코팅된 채혈 튜브를 사용하여 50-100μL의 혈액을 수집합니다. 멸균 거즈로 부위에 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다. 출혈이 멈추면 쥐를 우리로 되돌립니다.
메모: 수집되는 최대 혈액량은 일반적으로 주당 50μL 또는 2주마다 100μL입니다.
- 수집된 말초 혈액을 사용하여 hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19에 대한 항체와 함께 유세포 분석을 사용하여 인간 면역 세포 재구성 수준을 테스트합니다.
3. 항생제 치료
- 항생제 치료 전에 전처리 대변 샘플을 수집합니다. 마우스를 새로운 오토클레이브 마이크로아이솔레이터 케이지로 이동합니다.
- 매일 광범위한 항생제의 새로운 칵테일을 준비하십시오.
- 마우스의 각 마이크로아이솔레이터 케이지에 대해 갓 준비한 메트로니다졸(1g/L), 네오마이신(1g/L), 반코마이신(0.5g/L) 및 암피실린(1g/L)이 포함된 물 250mL를 준비합니다.
메모: 항생제가 보충된 식수는 오토클레이브 또는 멸균수를 사용하십시오.
- 항생제 보충 물 250mL에 포도당 가당 음료 믹스 9.2g을 첨가합니다.
메모: 포도 설탕 가당 음료 믹스를 사용하면 항생제의 쓴 맛을 가리고 쥐의 탈수를 예방하는 데 도움이 됩니다.
- 항생제와 포도 설탕, 가당 음료 믹스, 보충 물을 변경하고 마우스를 매일 새로운 오토클레이브 케이지에 넣습니다.
메모: 생쥐는 공생식(coprophagic)이며 매일 케이지를 교체하면 생쥐가 장내 세균을 다시 접종하는 것을 방지할 수 있습니다.
- 인간과 유사한 장내 마이크로바이옴의 생착을 극대화하려면 14일 동안 항생제를 투여합니다. 항생제 치료 중에는 쥐의 체중 감소 및 탈수 여부를 모니터링하십시오. 처음 3-4일 동안은 체중 감소가 예상되며 그 이후에는 치료 기간 동안 안정기가 예상됩니다. 탈수가 발생하면 복강내 주사를 통해 생쥐에게 식염수 또는 링거 용액을 투여합니다.
메모: 다른 장내 마이크로바이옴 인간화 프로토콜은 항생제의 경구 배계를 요구합니다. 쥐의 장내 세균을 고갈시키는 데 효과적이지만, 식수에 항생제를 첨가하는 덜 침습적인 방법이 인간화된 쥐에게 스트레스를 덜 주고 더 나은 결과로 이어진다는 것을 발견했습니다.
4. 기증자 샘플 및 대변 이식
- 인간 기증자 대변 샘플을 준비합니다.
- 인간화된 마우스에 대변 이식을 위해 적절하게 준비된 분변 미생물군 이식(FMT) 재료 소스를 사용하십시오.
- FMT 제제를 해동하고 혐기성 챔버에서 혐기성 조건에서 분취합니다.
- 원하는 경우 이 단계에서 배설물 샘플의 동일한 부분을 함께 혼합하여 편향되지 않은 "인간" 샘플을 만듭니다.
- FMT 물질의 동결 및 해동을 최소한으로 유지하고, 샘플의 분할 또는 혼합이 필요하지 않은 경우 절차 직전에만 해동하십시오.
- 인간 대변 이식
- 14일간의 항생제 치료 완료 후 식수를 오토클레이브 물로 변경하고 마우스를 새 오토클레이브 케이지로 옮깁니다. 일일 케이지 교체를 중단하고 1-2주에 한 번씩 케이지 교체 일정을 시행합니다.
- 항생제 투여 중단 후 24시간 및 48시간에 두 번의 대변 이식을 제공합니다.
- 항생제 투여 후 24시간 후, 필요한 양의 FMT 물질을 해동하고 경구 배당을 통해 각 마우스에 200μL의 FMT 물질을 투여합니다. 항생제 투여 후 48시간이 지나면 절차를 다시 반복합니다.
- 남거나 남은 해동된 FMT 물질을 인간화된 쥐의 털이나 케이지 침구에 펴 바릅니다.