다가 표시 외막 소포 백신 생성

Abstract

출처: Feng, R., et al. SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노 입자 백신 플랫폼입니다. J. Vis. 특급 (2022).

이 동영상은 다가 표시 외막소포체(OMV) 백신을 생성하는 방법을 보여줍니다. 포유류 세포는 SpyTag 및 폴리히스티딘 태그에 융합된 바이러스 항원을 발현하고 분비하기 위해 transfection됩니다. 그런 다음 이러한 항원은 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 친화성 컬럼을 사용하여 정제됩니다. 정제된 항원은 표면 결합 SpyCatcher(SC) 단백질을 발현하는 외막 소포와 혼합됩니다. 여러 항원이 SpyTag(ST)를 통해 SpyCatcher에 공유 결합되어 항원을 표시하는 OMV를 생성하여 다가 백신 역할을 합니다.

Protocol

1. 플라스미드 구조

1. 이전에 발표된 보고서에 따라 암피실린 내성 pThioHisA-Cytolysin A(ClyA) 플라스미드(재료 표 참조)에 암피실린 내성 pThioHisA-Cytolysin A(ClyA) 플라스미드(표 참조)를 삽입하여 이전에 발표된 보고서에 따라 플라스미드 pThioHisA ClyA-SC를 구성합니다.
2. 이전에 발표된 보고서에 따라 합성된 SpyTag-SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD)-polyhistidine tag (Histag) fusion gene (Figure 1)을 BamH I 및 EcoR I 부위 사이의 pcDNA3.1 plasmid(재료 표 참조)에 접합하여 plasmid pcDNA3.1 RBD-ST를 구축합니다.

2. OMV-SC 준비

1. 아래 단계에 따라 ClyA-SC 변환을 수행합니다.
   1. 5 μL의 pThioHisA ClyA-SC 플라스미드 용액(50 ng/μL)을 50 μL의 BL21 competent strain에 첨가하고 부드럽게 불어 얼음에서 30분 동안 식힙니다.
   2. 용액을 42°C의 수조에 90초 동안 넣은 다음 즉시 혼합 용액을 얼음 위에 3분 동안 놓습니다.
   3. 박테리아 현탁액에 500μL의 Luria-Bertani(LB) 배지를 첨가하고 혼합 후 220rpm, 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   4. 암피실린(100μg/mL, 재료 표 참조)이 포함된 LB 한천 플레이트에 모든 형질전환을 플레이트하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
      메모: 후속 실험에서, 암피실린은 배지에서 동일한 농도로 유지되었다. 그렇지 않은 경우 박테리아의 플라스미드 손실이 발생할 수 있습니다.
2. OMV-SC 프로덕션의 경우 아래 단계를 수행하십시오.
   1. 플레이트에서 단일 콜로니를 분리하고(단계 2.1.4.), LB(암피실린 내성) 배지 20mL로 37°C에서 220rpm으로 하룻밤 동안 배양합니다.
   2. 박테리아 용액 (단계 2.2.1)을 2L 배지에 접종하고 로그 성장 단계 (OD₆₀₀nm는 0.6에서 0.8 사이)까지 5 시간 동안 220 rpm, 37 ° C에서 배양합니다.
   3. 세균 용액의 600 nm에서 OD가 0.6-0.8에 도달하면 이소 프로필 베타 -D- 티오 갈락 토피라 노시드 (IPTG, 재료 표 참조)를 첨가하여 세균 용액의 최종 농도를 0.5 mM로 만든 다음 25 °C에서 220 rpm으로 하룻밤 동안 배양한다.
3. OMV-SC 정제를 수행합니다.
   1. 박테리아 용액을 7,000 x g에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
   2. 0.22μm 멤브레인 필터로 상층액을 여과한 다음 100kD 한외여과막 또는 중공사 컬럼을 사용하여 농축합니다(재료 표 참조).
   3. 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 농축액을 여과한 다음 초원심분리기(재료 표 참조)를 사용하여 150,000 x g, 4°C에서 2시간 동안 원심분리하고 피펫으로 상층액을 폐기합니다.
   4. PBS로 강수량을 재현탁하고 -80°C에서 보관합니다. 이 솔루션은 -80°C에서 장기 안정성을 유지할 수 있습니다.

3. RBD-ST 준비

1. 아래 단계에 따라 RBD-ST transfection을 수행합니다.
   1. 적절한 진핵생물 발현 시스템(예: HEK293F)을 선택하고 회수 후 37°C에서 130rpm으로 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.
   2. 20μL의 HEK293F 세포 용액을 자동화된 세포 카운터(재료 표 참조)에 추가하고, 세포 수를 기록하고, 농도를 1 x 106 cells/mL로 조정한 다음 130rpm, 37°C에서 4시간 동안 세포를 배양합니다.
   3. 0.22 μm 멤브레인 필터를 통해 RBD-ST 플라스미드를 여과하고 최종 부피가 10 mL가 될 때까지 300 μg의 플라스미드를 세포 배양 배지 (재료 표 참조)에 추가합니다. 10 초 동안 흔듭니다.
   4. 수조에서 폴리에틸레니민(PEI, 1mg/mL, 재료 표 참조)을 65°C로 가열하고 PEI 0.7mL와 세포 배양 배지 9.3mL를 혼합한 다음 10초 동안 간헐적으로 흔듭니다.
      메모: 용액을 세게 흔들지 마십시오. 그렇지 않으면, 결과적인 기포는 형질주입 효율에 영향을 미칠 수 있다.
   5. PEI 용액에 플라스미드 용액을 첨가하고 혼합물을 10초 동안 간헐적으로 흔든 다음 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
   6. 혼합물을 280mL의 세포 배양 배지에 첨가하고 130rpm에서 37°C에서 5일 동안 배양합니다.
2. RBD-ST 정제를 수행합니다.
   1. 6,000 x g에서 25°C에서 20분 동안 세포를 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 수집합니다.
   2. 컬럼에 Ni-NTA 아가로스 2mL를 채우고(재료 표 참조) PBS 3개로 3배 세척합니다.
   3. 세포 상등액에 이미다졸(재료 표 참조)을 첨가하여 최종 농도를 20mM로 만들고 세포 상등액을 2배로 로드합니다.
   4. 세척을 위해 20mM의 이미다졸을 함유한 PBS의 3 컬럼 부피(CV)를 추가하고 세척 분획을 수집합니다.
   5. 저농도에서 고농도(예: 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M)의 이미다졸을 포함하는 PBS의 3 CV로 그래디언트 용리, 각 농도에 대해 2배 용리.
   6. SDS-PAGE를 사용하여 다양한 농도 구배에서 RBD-ST를 식별합니다.

4. OMV-RBD 생체접합 및 정제

1. bicinchoninic acid assay(BCA) 방법으로 단백질 농도를 측정합니다(재료 표 참조).
   1. 표준 소 혈청 알부민(BSA) 단백질 용액을 2mg/mL에서 0.0625mg/mL로 연속 희석하고 정제된 OMV-SC 및 RBD-ST 10x를 희석한 다음 BCA 작업 용액 A와 B(분석 키트에 제공됨)를 50:1(v/v)의 비율로 혼합합니다.
   2. 묽게 된 단백질 해결책 (25 μL/well)를 추가하고 BCA 작동 해결책 (200 μL/well)와 섞으십시오; 37 °C에 30 분 동안 배양하십시오.
   3. 각 웰의 562nm에서 흡광도(OD)를 측정하고 표준 곡선에서 단백질 농도를 계산합니다.
2. 아래 단계에 따라 OMV-SC 및 RBD-ST의 생체접합을 수행합니다.
   1. PBS에서 OMV-SC와 RBD-ST를 40:1(w/w) 비율로 혼합합니다.
   2. 수직으로 회전하여 4°C에서 15rpm으로 밤새 혼합물을 혼합합니다.
      메모: 다른 항원은 다른 비율로 반응할 수 있습니다. 항원의 특성에 따라 다른 반응 비율을 시도할 수 있습니다.

Results

그림 1: 본 연구에서 사용된 플라스미드 서열.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
암피실린 나트륨	(주)상곤바이오텍	A610028
자동 세포 계수기	카운트 스타	생명 공학
BCA 단백질 정량 분석 키트	CWBIO	CW0014S
전기영동 장치	카보이	파워 BV
고속 냉동 원심 분리기	바이오리지	H2500R의
His-Tag 마우스 mAb	세포 신호 전달 기술	2366초
이미다졸	(주)상곤바이오텍	A600277
이소프로필 베타-D-티오갈락토피라노사이드	(주)상곤바이오텍	A600118
Ni-NTA His-Bind 수퍼 플로우	키아겐	70691
OPM-293 세포 배양 배지	OPM 생명과학	81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST 플라스미드	우한 genecreat 생물학 techenology
인산염 완충액 식염수	ZSGB-바이오	즐리-9061
폴리에틸렌이민 선형	폴리사이언스	23966-1
미리 염색된 단백질 래더	열	26616
pThioHisA ClyA-SC 플라스미드	우한 genecreat 생물학 techenology
Quixstand 벤치탑 시스템(100kD 중공사 컬럼)	GE 헬스케어
SDS-PAGE 로딩 버퍼(5x)	베이오타임	P0015
소금	(주)상곤바이오텍	A100241
서스펜션 계기	생명 기술	훌라 믹서
트립톤	옥소이드	LP0042B
초원심분리기	베크만 쿨터	XPN-100
자외선 분광 광도계	히타치	U-3900
효모 추출물	(주)상곤바이오텍	A610961