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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
Balb/cYJ (H2d) 공여체 마우스와 C57Bl/6 (H2b) 수혜자 마우스를 사용하여 동종 반응을 조사합니다. 마우스는 8주에서 12주 사이의 실험에 사용됩니다. 암컷 또는 수컷 마우스를 사용하십시오. Syngeneic control은 C57Bl/6 기증자에서 C57Bl/6 수혜자로의 대동맥 분절로 구성됩니다.
1. 기부자 및 수혜자 준비
참고: 기증자와 수혜자 모두 이식편의 허혈을 최소화하기 위해 수술 전에 마취 및 준비를 합니다. 흡입 마취제의 전달에 필요한 장비에 의한 동물의 방해를 방지하기 위해 프로토콜에 주사용 마취제가 사용됩니다. 그러나 원하는 경우 흡입 마취제가 적절한 대안이 될 수 있습니다. 마취제의 초기 주입부터 전체 절차를 완료하는 데 약 90분이 소요됩니다. 이식편의 허혈 시간은 30분 미만입니다.
- 케타민(100mg/kg, 10mg/ml) 및 자일라진(10mg/kg, 1mg/ml)의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다. 마우스는 10분에서 15분 이내에 진정됩니다. 동물 발 패드의 지방 부분을 꼬집어 마취 깊이를 평가합니다. 동물이 금단 반사를 보이지 않을 때까지 필요에 따라 마취 칵테일의 원래 용량의 1/3을 투여합니다. 모든 칵테일을 투여한 후 호흡수를 면밀히 모니터링하십시오. 수술 중에는 15분마다 한 쌍의 집게로 복부 전벽을 꼬집어 마취 수준을 평가합니다. 마우스는 60-90분 동안 깊이 마취된 상태를 유지해야 합니다.
- 마취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 안과 연고로 마우스의 눈을 윤활합니다.
- 흉부 중간에서 치골까지 복부 복부 부위의 피부에 최대한 가깝게 수염을 면도합니다. 피부에 상처가 나지 않도록 특히 주의하세요. 제모 크림은 피부에 흡수되어 염증을 유발할 수 있으므로 사용하지 마십시오.
- 동물을 난방 테이블이나 패드 위의 수건 위에 누운 상태로 놓습니다.
- 2% 클로로헥시딘이 함유된 예비 스크럽으로 수술 부위를 청소합니다. 수술 영역을 최대화하기 위해 넓은 작업 영역을 준비하십시오. 수술 부위 중앙에서 스크럽을 시작하여 선형 또는 원형으로 바깥쪽으로 이동합니다. 거즈를 버리십시오. 이 절차를 5회 이상 반복합니다. 같은 부위에 알코올 준비 패드를 바릅니다. 알코올이 마르면 베타딘 용액으로 깨끗한 부위를 준비하고 멸균 거즈로 덮습니다.
2. 종단 간 문합 절차
- 기부자 작업
- 작업 전반에 걸쳐 무균 기술을 유지하십시오. 사용하기 전에 모든 조리대와 수술대 표면을 0.5% 가속 과산화수소 용액으로 청소하십시오. 사용하기 전에 모든 수술 기구, 거즈, 커튼 및 가운을 감싸고 오토클레이브하십시오. 각 팩에 배치된 증기 멸균기 표시기 스트립으로 기구의 멸균 상태를 확인하십시오. 멸균 수술용 장갑은 수술 사이에 사용하고 폐기합니다. 여러 번의 수술의 경우 뜨거운 유리 구슬 살균기로 사용 사이에 수술 기구를 소독하십시오.
- 멸균 드레이프로 감싼 깨끗하고 얇은 플렉시글라스 보드에 누운 기증자 마우스를 8-30X 배율로 작동 현미경 아래에 놓습니다.
- 섹션 1.1에 설명된 대로 적절한 외과적 마취를 확인한 후 수술을 진행합니다.
- 멸균 가위를 사용하여 치골에서 xyphoid process까지 단일 정중선 하부 세로 복부 절개를 만듭니다.
- 작은 견인기를 사용하여 복벽을 열어 구멍을 노출시킵니다.
- 멸균 솜 끝이 있는 어플리케이터를 사용하여 장을 동물의 왼쪽 위로 부드럽게 집어넣고 식염수를 적신 거즈로 덮습니다. 생식 기관을 하부로 이동하고 하측 대동맥과 하대정맥(IVC)을 찾습니다. 노출된 조직을 주기적으로 식염수로 적십니다.
- 의료용 5번 겸자를 사용하여 대동맥을 IVC에서, 좌측 신장 동맥 수준에서 분기점까지 분리합니다. 10-0 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 대동맥 근처의 작은 가지를 접합합니다.
- 공여자의 대동맥이 IVC에서 분리되면 혈관을 식염수로 적시고 노출된 구멍을 적신 거즈로 덮은 다음 공여자를 멸균 구역에 따로 둡니다. 15분마다 기증자의 상태(호흡기 및 심혈관 기능, 마취 깊이)를 확인합니다. 아래 설명된 대로 대동맥을 분리하여 수혜자에 대한 수술을 시작합니다(단계 2.2.1 - 2.2.7).
- 수용자 대동맥이 IVC에서 분리되어 따로 보관되면 기증자를 현미경으로 되돌립니다. 교차 클램프(관심 세그먼트에 대한 근위 및 원위부) 기증자 대동맥은 약 5mm 떨어져 있으며 2개의 4mm 미세혈관 클램프가 있습니다.
- Vannas-Tubingen 마이크로 가위를 사용하여 복부 대동맥의 작은 이식편 분절(3-4mm 길이)을 절제합니다.
- 주사기에 부착된 25G 5/8 바늘을 사용하여 절제된 대동맥을 헤파린화된(100U/ml) 식염수로 세척합니다. 바늘 끝이 용기에 닿지 않도록 하십시오.
- 대동맥을 헤파린화된(100U/ml) 식염수에 넣고 얼음 위에 올려 놓습니다. 깊은 마취 상태에서 미세혈관 클램프를 해제합니다. 기증자를 피출혈로 안락사시킨다.
- 절제 후 30분 이내에 기증자 혈관을 이식합니다. 더 긴 길이의 대동맥을 절제하여 여러 수용자에 대해 하나의 기증자 혈관을 사용할 수 있지만 허혈 시간을 30분 미만으로 유지하십시오.
- 수신자 작업
- 기증자 작업에서와 같이 작업 전반에 걸쳐 무균 기술을 유지합니다.
- 누운 마우스를 멸균 드레이프로 감싼 얇은 플렉시글라스 보드에 누운 상태로 8-30X 배율로 작동 현미경 아래에 놓습니다.
- 적절한 마취를 확인한 후 동물이 금단 반사를 보이지 않을 때 수술을 진행하십시오.
- 멸균 가위를 사용하여 치골에서 xyphoid process까지 단일 정중선 하부 세로 복부 절개를 만듭니다.
- 작은 견인기를 사용하여 복벽을 열어 구멍을 노출시킵니다.
- 멸균 솜 끝이 있는 어플리케이터를 사용하여 장을 동물의 왼쪽 위로 부드럽게 집어넣고 식염수를 적신 거즈로 덮습니다. 생식 기관을 하위로 움직이고 대동맥과 IVC를 찾습니다. 노출된 조직을 주기적으로 식염수로 적십니다.
- 대동맥과 IVC를 분리하고, 왼쪽 신장 동맥 수준에서 분기점까지 분리합니다. 필요한 경우 10-0 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 대동맥 근처의 작은 가지를 접합합니다.
- 교차 클램프 (관심 세그먼트에 대한 근위 및 원위부) 대동맥은 약 5mm 떨어져 있으며 2 개의 4mm 미세 혈관 클램프가 있습니다.
- Vannas-Tubingen 마이크로 가위를 사용하여 단일 수평 대동맥 절개술을 만들고 복부 대동맥의 작은 부분(0.5mm 이하)을 절제하여 기증자 대동맥 이식편을 수용합니다.
- 절제된 대동맥을 헤파린화된(100 U/ml) 식염수로 세척합니다. 기증자 대동맥 이식편은 수혜자의 절제된 대동맥 말단을 연결할 수 있는 적절한 길이여야 합니다.
- 기증자 대동맥 이식편을 정립성 위치에 놓고 기증자의 이식편 끝을 수혜자의 끝과 문합하여 각 이식편의 해부학적 방향을 수혜자의 방향과 일치시킵니다.
- 혈관의 tunica externa를 부드럽게 잡고 의료용 No.5 겸자를 사용하여 약간 고정합니다. 겸자를 사용하여 10-0 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사에 부착된 바늘을 혈관 벽의 전체 두께를 통해 밀어 넣어 기증자 대동맥 이식편을 수혜자의 절제된 혈관에 고정합니다. 용기 뒤쪽 벽의 부주의한 스티치로 인해 용기 입구가 닫히지 않았는지 확인하십시오.
- 지속적인 스티치를 위해 이식편의 상단과 하단 모두에서 9시 방향에 스테이 봉합사를 배치하십시오. 3시 방향에서 이식편의 상단에서 시작하여 2개의 러닝 봉합사로 절제된 끝을 문합하고 봉합사를 스테이 봉합사에 고정합니다.
- 이식편을 뒤집고 혈관의 등쪽 부분으로 흐르는 봉합사를 계속하여 원점 유지 봉합사를 만납니다. 용기에 많은 압력을 가하지 않고 고정하십시오. 하부 문합에 대한 봉합을 반복합니다.
참고: 중단된 봉합사는 연속 봉합사와 동일한 방식으로 시작하지만, 혈관이 스테이 봉합사 사이에 세 개의 개별 스티치로 문합된다는 점을 제외하고는 합니다. 문합 시간은 일반적으로 20분입니다.
- 문합이 완료되면 원위 미세혈관 클램프를 풀어 역행성 혈액이 흐르도록 하고 문합 부위의 누출을 확인합니다. 누출이 있는 경우 즉시 스티치를 하여 결함 부위를 닫으십시오. 해당 부위에 출혈이 없으면 근위 클램프를 해제합니다.
- 이식을 검사하고 이식편과 수혜자 혈관의 근위 및 원위 부분에 혈액 폐색이 없는지 확인합니다. 기증자와 수혜자의 혈관에서 격렬한 맥박 패턴이 보인다는 것은 혈액이 자유롭게 흐른다는 것을 나타냅니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 스테이 봉합사의 한쪽 끝을 부드럽게 잡고 혈관의 뒤쪽 벽을 검사하기 위해 혈관을 약간 절단합니다.
메모: 문합된 부위의 양쪽 끝에서 혈관 벽이 주름지지 않아야 합니다. 클램프를 제거한 후 혈류가 좋지 않은 것은 혈전증의 징후입니다.
- 솜 끝이 있는 어플리케이터를 사용하여 장을 복강으로 되돌려 놓습니다.
- Castroviejo 바늘 홀더와 Graefe 집게를 사용하여 연속 스티치를 사용하여 5-0 폴리프로필렌 봉합사로 복벽을 닫습니다. 피하 봉합을 사용하여 동일한 봉합사로 피부층을 봉합합니다.
- 이식 완료 즉시 Torbugesic(1mg/kg)을 투여합니다.
- 즉시 아티파메졸(1mg/kg), 케토프로펜(5mg/kg), 따뜻하게 한 젖산링거 용액을 순서대로 피하로 투여합니다.
- 수술 직후, 생쥐를 물 담요 아래 가열된 케이지에 하룻밤(12시간) 동안 눕힙니다. 마취 회복 기간 동안에는 깨끗하고 건조하며 장애물이 없는 곳에 동물을 혼자 두십시오. 케이지(오토클레이브)에 깨끗한 종이 타월을 깔고 물 담요의 온도를 약 20-22°C로 조정합니다.케이지 바닥에 건조하고 젖은 사료를 자유롭게 제공하십시오.
메모: 수술 후 관리의 필수 구성 요소는 마취 및 수술에서 회복하는 동안 동물을 관찰하고 필요에 따라 적절한 개입을 하는 것입니다. 필요한 모니터링 강도는 동물에 따라 다르며 수술 후 회복 후보다 즉각적인 마취 회복 기간 동안 더 클 수 있습니다.
- 마취를 받은 동물이 완전히 회복될 때까지 지속적으로 모니터링하십시오. 동물은 도움 없이 흉골 누운기를 유지할 수 있어야 하며, 방치되기 전에 침착하고 고통이 없는 것처럼 보여야 합니다.
- 부프레노르핀(0.1mg/kg BID)과 케토프로펜(5mg/kg SID)을 3일 동안 모두 피하주사합니다.
- 최소 3일 동안 심혈관 및 호흡 기능, 체온, 마취 후 회복 중 수술 후 통증 또는 불편함을 모니터링합니다. 탈수 및 전해질 손실을 최소화하기 위해 진통제 및 기타 약물 및 비경구 수액을 투여하는 것과 같은 추가 주의가 필요할 수 있습니다.
- 뒷다리의 운동 기능을 관찰하여 이식 수술의 성공 여부를 평가합니다. 이식의 완전한 성공은 뒷다리와 꼬리로의 혈류를 방해하지 않는 것이며, 이는 동물이 회복되는 즉시 이루어져야 하며, 둘째 날에는 뒷다리의 마비 없이 완전히 회복
되어야 합니다.