혈관화된 이종성 비장 이식의 마우스 모델

초록

출처: Wang, J., et al. 비장 세포 생물학 및 이식 면역 연구를 위한 혈관화된 이소성 비장 이식의 마우스 모델. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 혈관화된 이종성 비장 이식의 마우스 모델을 생성하는 수술 방법을 보여줍니다. 마취된 기증자 마우스의 복강을 외과적으로 열어 비장을 제거합니다. 하대정맥(inferior vena cava)과 대동맥(infrarenal aorata)을 확인하고, 요추 가지를 결찰하고, 선천성 기증자 마우스(congenic donor mouse)의 비장을 이종(heterotopic transplant)으로 이식할 수 있는 구멍을 만듭니다. 혈관 문합을 완료하고 이식된 비장으로의 혈류를 회복시키면 절개 부위를 봉합하고 마우스의 회복을 모니터링합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 외과적 준비, 마취 및 진통제

요법

1. 수술 플랫폼에 멸균 일회용 드레이프(45.7cm x 66cm)를 놓습니다. 마우스를 부드럽게 잡고 마취를 위해 케타민(50mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 복강내(ip)로 주사하고 진통제를 위해 0.05mg/kg 부프레노르핀을 피하로 주사합니다.
2. 발가락 꼬집기로 마취 깊이를 확인하고 면도기로 복부 전체의 수염을 면도한 다음 6-10x 배율로 작동 현미경 아래 멸균 수술 플랫폼에 마우스를 놓습니다.

2. 기증자 비장 수확

1. 알코올 준비 패드로 복부를 소독하고 수술 테이프로 팔다리를 고정하고 가위로 치골에서 xiphoid process까지 3-4cm의 정중선 수직 피부 절개를 만듭니다.
2. 클립으로 만든 멸균 견인기로 복벽을 집어넣습니다. 멸균 면봉으로 장을 복부의 오른쪽 측면(외과 의사의 왼쪽)으로 이동하여 비장을 노출시킵니다. 비장에 부착된 짧은 위 정맥을 멸균 저온 소작기로 소작합니다(그림 1A). 37°C의 식염수를 적신 멸균 거즈 조각을 비장 위에 올려 촉촉하게 유지합니다(그림 1B).
3. 문맥 가지(superior pancreaticoduodenal vein 및 right 위 정맥)를 결찰하여 췌장 조직(그림 1C)에서 문맥을 분리하고 동원합니다.비장 정맥에서 원위부에 있는 문맥 주위에 봉합사를 놓습니다(그림 1D).
4. 비장을 오른쪽으로 뒤집어 대동맥과 체강 몸통을 비장 동맥과 함께 노출시킵니다(그림 1E). 간 동맥과 위 동맥을 결찰하여 대동맥-체강 비장 동맥을 해부하고 동원합니다. 체강 동맥 근위부 대동맥 주위에 봉합사를 놓습니다(그림 1F-G).
5. 하대정맥(IVC)에 헤파린 100IU(International Unit)를 주입하여 전신을 헤파린화하고 헤파린이 효과를 발휘할 때까지 3분 동안 기다립니다. 복부 대동맥 근위부에서 복강 동맥 근위부로 접합하고 문맥을 횡절한 다음 복부 대동맥 원위부에서 복강 몸통까지 10mL의 간압연(4°C) 식염수(10mL/20초)를 사용하여 전신을 관류합니다(그림 1H).
6. 관련 대동맥-체강-비장 분절 및 문맥과 함께 비장 정맥 분절 및 췌장 조직의 작은 부분과 함께 비장 이식편을 일괄적으로 수집합니다. 이식 전에 이식편을 4°C 식염수 5mL에 보존합니다. 경추 탈구로 마우스를 안락사시킵니다.

3. 수혜자 비장 절제술 및 비장 이식편 이식

1. 수술 플랫폼에 가열 패드를 놓고 온도를 37°C로 조정합니다.가열 패드 위에 멸균 드레이프(45.7cm x 66cm)를 놓고 멸균 수술 플랫폼을 만듭니다. 수술 준비 및 마취를 위해 2.1단계와 2.2단계를 반복합니다. 2.1단계와 2.2단계에서 설명한 대로 3-4cm의 정중선을 절개하고 복벽을 후퇴시킵니다.
2. 멸균 면봉으로 장을 마우스의 오른쪽으로 조심스럽게 움직여 수혜자의 비장을 노출시킵니다. 비장 정맥과 동맥을 결찰하고 비장을 제거합니다.
3. 장을 마우스의 왼쪽으로 조심스럽게 이동하고 젖은 거즈(멸균 37°C 식염수로 적신 것)로 장을 덮습니다. infrarenal 대동맥과 IVC의 요추 가지를 절개하고 결찰합니다. 두 개의 4mm 미세혈관 클램프를 사용하여 대동맥과 IVC를 교차 클램핑합니다.
4. 대동맥 내측(전체 두께)을 통해 11-0 나일론 봉합사를 배치하고 후퇴시켜 마이크로가위로 한 번 절단하여 타원형 대동맥 절개술을 만듭니다(길이는 공여자 대동맥의 직경과 일치해야 함, 그림 2A). 30G 바늘을 사용하여 IVC를 뚫어 타원형 정맥 절개술을 만들고 마이크로 가위를 사용하여 기증자 문맥 일치 길이로 개구부를 확장합니다(그림 2A).
5. 500μL의 헤파린 식염수(10단위/mL)로 관내 혈액 또는 혈전(대동맥 및 IVC)을 제거합니다.
6. 비장 이식편을 수혜자 마우스 복부의 오른쪽 측면에 배치하고, 기증자의 대동맥 커프와 기증자의 문맥을 주의 깊게 확인한다. 혈관이 뒤틀리지 않았는지 확인한 후 냉기(4°C) 식염수를 적신 거즈로 비장 이식편을 덮습니다.
7. 기증자의 대동맥 커프를 두 개의 스테이 봉합사(11-0 나일론 봉합사, 아래와 동일)를 사용하여 수혜자의 대동맥 절제술의 근위 및 원위 정점에 연결합니다(그림 2B, C). 기증자의 대동맥 커프와 수혜자의 대동맥 절개술(전벽) 사이에 11-0 나일론 봉합사를 2-3회 연속으로 물려 문합을 합니다(그림 2D). 비장 이식편을 수혜자의 왼쪽으로 뒤집습니다. 기증자의 대동맥 커프와 수혜자의 대동맥 절개술(후벽) 사이에 문합을 만듭니다(그림 2E).
8. IVC 내부를 4-5회 연속 봉합사를 사용하여 기증자의 문맥을 수혜자의 IVC 후벽에 연결하는 문합을 수행한 다음 IVC 외부의 봉합사를 닫습니다(그림 2F, G).
9. 용기 클램프를 풀고 멸균 면봉을 사용하여 비장 색이 회복될 때까지 출혈을 탐포네이드합니다(그림 2H).
10. 5-0 합성 흡수성 비크릴 봉합사로 복부를 연속적인 패턴으로 봉합합니다. 중단된 패턴으로 5-0 나일론 봉합사로 피부층을 닫습니다.
    메모: 3.7-3.8 단계의 경우, 또는 기증자의 문맥과 수혜자의 IVC 사이를 먼저 문합합니다(3.8단계). 그런 다음 대동맥 내부에 2-3개의 연속 봉합사를 사용하여 기증자의 대동맥 커프와 수혜자의 대동맥 절개술의 후벽 사이를 문합하고 대동맥 바깥쪽의 봉합사를 닫습니다.

4. 동물 회복

1. 복부를 봉합한 후 4개의 별도 위치(0.25mL/위치)를 통해 따뜻한 식염수 1mL를 피하주사합니다.
2. 작동 후 처음 몇 시간 동안은 마우스를 온도 조절 인큐베이터(30°C)에 보관하고 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 모니터링한 다음 케이지 아래에 가열 패드(30°C)가 있는 일반 음식과 물이 있는 깨끗한 새 케이지로 마우스를 옮깁니다. 수술 후 쥐는 별도의 케이지에 보관하십시오.

5. 수술 후 통증 관리

1. 진통 요법을 유지하기 위해 수술 후 24시간 및 48시간 후에 0.05mg/kg 부프레노르핀을 피하 주사합니다.

결과

그림 1: 공여체 비장 채취. (A) 비장에 부착된 짧은 위 정맥을 소작합니다. (B) 비장에 작고 살균된 따뜻한 젖은 거즈를 씌워 촉촉하게 유지합니다. (C) 췌장 뒤의 문맥을 절개하고 분리합니다. (D) 문맥의 곁가지를 결찰하고 비장 정맥 원위부에 있는 문맥 주위에 봉합사를 놓습니다. 점선은 수용자 IVC와의 문합을 위해 나중에 횡단하는 위치를 나타냅니다. (E) 비장을 복부의 오른쪽(외과 의사의 왼쪽)으로 뒤집어 비장 동맥을 포함한 가지와 함께 대동맥과 체강 몸통을 노출시킵니다. (F) 다른 두 가지를 결찰하여 대동맥-체강 -비장 동맥...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케타민	와이어스	제206205-01
자일라진	로이드 연구소	139-236
헤파린 용액	Abraxis 제약 제품	504031
주입 등급 일반 식염수	주식회사 호스피라	국토교통위원회 0409-4888-20
70% 에탄올	Pharmco 제품 Inc.	111000140
ThermoCare 소동물 ICU 시스템	써모케어, Inc.
애드슨 겸자	Roboz 수술 기구	RS-5230
Derf 바늘 홀더	Roboz 수술 기구	RS-7822
초극세 마이크로 해부 가위	Roboz 수술 기구	RS-5881
마이크로 클립	Roboz 수술 기구	RS-5420
7-0 실크	브레인트리 사이언티픽	SUT-S 103
11-0 나일론에 4mm (3/8) 바늘	샤포인트 DR4	AK-2119
Ms CD45.2 항체	BD 생명과학	553772
Ms CD45.1 항체	BD 생명과학	553776
Ms CD11b 항체	BD 생명과학	557657
Ms B220 항체	BD 생명과학	553089
Ms Ly6C 항체	이바이오사이언스	Tel.: 48-5932-80
Ms Ly6G 항체	BD 생명과학	561236
Ms F4/80 항체	BD 생명과학	565614
Ms CD11c 항체	BD 생명과학	558079
Ms CD3 항체	이바이오사이언스	Tel.: 48-0032-82
Ms CD4 항체	BD 생명과학	552051
Ms CD8 항체	BD 생명과학	563786
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