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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. BCG(Bacillus Calmette-Guerin) 덴마크어 및 Mycobacterium tuberculosis H37Rv의 정량화된 글리세롤 스톡의 제조
참고: 설명된 모든 프로토콜은 생물 안전 수준 3(BSL3) 조건에서 수행되었습니다.
- BCG 덴마크어 또는 H37Rv 균주의 냉동 글리세롤 스톡을 해동하고 Tween-80 0.05%(v/v) 및 ADC(알부민, 덱스트로오스, 카탈라아제) 10%(v/v)가 보충된 7H9 배지 10ml에 100μl를 접종합니다.
- 배양이 로그 단계 성장이 될 때까지 37 °C에서 1주일 동안 정적 조건에서 배양합니다.
- 10ml 배양액을 200ml의 신선한 배지로 옮겨 박테리아 배양을 확장합니다. 정적 조건에서 추가로 20일 동안 배양합니다.
- 50ml 원심분리기 튜브에 넣고 2500 x g에서 15분 동안 원심분리기
를 사용합니다.
- 상등액을 버리고 잔류 부피에 박테리아 펠릿을 재현탁합니다. 각 튜브에 직경 3mm의 멸균 유리 구슬을 추가합니다(튜브당 10 - 15개).
- 박테리아 덩어리를 해리하기 위해 1분 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 각 펠릿을 10ml의 인산염 완충 식염수(PBS)에 Tween-80 0.05%(v/v)로 재현탁합니다.
- 튜브를 10분 동안 그대로 두어 가장 큰 박테리아 응집체와 유리 구슬이 가라앉을 수 있도록 합니다.
- 작은 덩어리와 단일 박테리아를 포함하는 4개의 튜브 각각에서 9.5ml의 상층액을 회수하고 하나의 새로운 50ml 원심분리 튜브(최종 회수 부피 38ml)로 부피를 옮깁니다. 400 x g에서 10분간 원심분리기
.
- 하나의 새로운 50ml 원심분리기 튜브에서 35ml의 상등액(주로 단일 박테리아 포함)을 회수하고 15ml의 PBS와 글리세롤 50%(v/v)를 첨가하여 최종 글리세롤 농도 15%(v/v)를 얻습니다.
- 부드럽게 섞어 1ml의 분취액에 담아 적절한 튜브에 넣어 얼립니다. -80 °C에서 보관하십시오 (한 로트는 약 50 개의 글리세롤 스톡을 제공합니다).
- 글리세롤 스톡을 정량화하려면 동결 다음 날 글리세롤을 해동하고 900μl의 PBS가 포함된 별도의 1.5ml 튜브에서 7번의 10배 연속 희석을 수행합니다.
- 55mm 직경의 페트리 접시에서 준비된 ADC 10%(v/v)가 보충된 7H10 고체 한천 배지에 각 희석액 100μl를 플레이트
화합니다.
- 직경 3mm의 유리 구슬(플레이트당 약 10개)을 조심스럽게 넣고 플레이트를 부드럽게 흔들어 한천 플레이트에 부피를 균등하게 분배합니다. 구슬을 버리고 파라필름으로 한천 플레이트를 밀봉합니다.
- 37°C에서 21일 동안 배양하고 단일 콜로니를 정확하게 구별할 수 있는 희석액에서 콜로니 형성 단위(CFU)를 계수하여 박테리아 농도를 측정합니다.
2. 마우스 백신 접종
- 사전 정량화된 BCG 글리세롤을 해동하고 PBS에서 희석하여 두 개의 현탁액을 준비합니다. 동물당 투여량이 피하 투여의 경우 100μl(피하 백신 접종의 경우 ml당 10,7CFU), 비강 투여의 경우 40μl(비강 내 백신 접종의 경우 2.5 x 10,7 CFU)임을 고려하여 최종 부피를 계산합니다.
- 설치류를 위한 특수 마취 워크스테이션을 사용하여 이소플루란과 산소의 혼합물로 생쥐를 마취합니다. 이소플루란 5%를 사용하여 마취를 유도하고 2%를 사용하여 마취실에서 마우스를 유지합니다. (다른 허용되는 마취 방법을 사용할 수 있습니다).
- 피하 백신 투여의 경우 1ml 주사기에 26G 바늘에 1ml의 박테리아 현탁액(10,7CFU/ml)을 채웁니다. 기포를 제거하십시오.
- 마취된 마우스를 층류 후드 내부의 엎드린 자세로 평평한 표면에 놓고 마우스 등 측면에 100μl(10,6CFU/용량)의 백신을 피하 접종합니다. 마우스를 케이지로 되돌리고 모니터링하여 마취에서 제대로 회복되는지 확인합니다.
- 각 마우스 투여 사이에 주사기 바늘을 교체하십시오. 위에서 설명한 대로 기포를 제거했습니다.
- 비강 내 투여를 위해 마취된 마우스를 후드 내부의 누운 자세로 놓습니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 2.5 x 107 CFU/ml의 현탁액 20μl를 취합니다. 전체 부피가 쌓일 때까지 두 콧구멍 사이에 접종물을 한 방울씩 놓고 마우스가 부피를 호흡할 수 있도록 방울 사이의 시간을 둡니다.
참고: 생쥐는 이 절차를 수행하는 동안 호흡 곤란을 겪을 수 있으므로 가능한 한 많이 방지하기 위해 다음 방울을 투여하기 전에 각 방울을 동화시키도록 두어야 합니다.
- 마이크로피펫에 20μl를 더 채우고 작업을 반복합니다. 첫 번째 접종 후 마우스가 마취에서 깨어나기 시작하면 두 번째 접종 전에 마취실에 넣습니다. 마우스를 케이지로 되돌리고 마취에서 제대로 회복되었는지 확인합니다.
3. H37Rv 스트레인을 사용한 마우스 비강 내 챌린지
- 사전 정량화된 H37Rv 글리세롤을 해동하고 PBS에 희석하여 ml당 2,500CFU의 박테리아 현탁액을 준비합니다. 동물당 용량이 40μl인 것을 고려하여 최종 부피를 계산합니다.
- H37Rv는 2.5 - 2.7에 기재된 바와 같이 비강내 접종합니다. 마우스당 최종 챌린지 용량은 102 CFU/40 μl입니다.