쥐 모델에서 광범위한 대뇌 피질 탈수초 발생

초록

출처: Üçal, M. et al., 전염증성 사이토카인의 뇌내 주입에 의해 유도된 광범위한 대뇌 피질 탈수초의 쥐 모델. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 대뇌 피질 탈수초화가 널리 퍼진 쥐 모델을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이것은 재조합 미엘린 수초 단백질로 준비된 쥐에 전염증성 사이토카인을 주입하여 혈액-뇌 장벽을 파괴하는 것을 포함합니다. 이 과정은 면역 세포의 침투를 촉진하여 광범위한 대뇌 피질 탈수초를 초래합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 재료 준비

참고: 수술은 무균 상태에서 진행됩니다. 시작하기 전에 드릴 비트를 포함한 모든 수술 기구를 적절한 소독제로 세척해야 합니다.

1. 마취 혼합물을 준비합니다: 펜타닐 0.02mg/mL, 미다졸람 0.4mg/mL, 메데토미딘 0.2mg/mL(혼합물의 최종 농도).
   참고: 대체 마취제에 대해서는 해당 토론 섹션을 참조하십시오.
2. 해독제 혼합물을 준비합니다: 플루마제닐 0.07mg/mL 및 아티파메졸 0.42mg/mL(혼합물의 최종 농도).
3. 카테터와 카테터 캡을 주입구와 나사로 조립합니다. 메스로 카테터를 2mm 길이로 자릅니다(그림 1).
   참고: 가위는 카테터 팁의 원형 단면 모양을 짜거나 왜곡시키므로 이를 위해 사용하지 마십시오.

2. 수술 준비

1. 마취제 혼합물(체중의 1.5mL/kg)을 복강내 투여하여 쥐를 마취합니다.
2. 전기 면도기를 사용하여 귀 사이 쥐의 머리를 면도하십시오. 동물을 배치하기 전에 정위 프레임에 동종 담요를 놓아 수술 내내 저체온증을 피하십시오.
3. 이어바와 바이트 플레이트를 사용하여 정위 프레임에 쥐의 머리를 고정시켜 머리가 수평이고 안정적인지 확인합니다. 손가락이나 집게로 두개골에 압력을 가하여 안정성을 확인하십시오.
   알림: 정위 프레임 내에서 느슨한 고정 및 수평이 아닌 배치는 의도한 좌표에서 벗어날 수 있습니다.
4. 수술 중 각막 건조를 방지하기 위해 윤활 안약을 바르십시오. 수술용 빛에 노출되지 않도록 불투명한 물질로 눈을 가리십시오.
5. 70% 에탄올과 10% 포비돈-요오드 복합체를 번갈아 가며 도포하여 면도한 부위를 청소합니다.
   참고: 감염을 방지하기 위해 수술 중 모든 예방 조치를 따르십시오. 수술은 무균 상태에서 진행됩니다. 무균 상태가 손상되면 오염된 물질을 교체해야 합니다.

3. 카테터 이식

1. 머리 피부의 중앙을 2cm 정도 길이의 세로 절개를 합니다. 불독 클램프를 사용하여 피부를 옆으로 고정합니다. 이러한 단계에 대한 개요는 그림 2를 참조하십시오.
2. 끝이 솜으로 된 애플리케이터를 사용하여 혈액을 제거합니다.
3. 두개골 골막을 제거합니다. 솜팁 어플리케이터로 조직을 청소하고 두개골 뼈를 노출시킵니다. 두개골을 약 1분 동안 건조시킵니다.
4. 해부학적 랜드마크, Lambda, Bregma 및 medial suture를 식별합니다. 드릴을 정위 프레임에 설치한 상태에서 드릴 팁을 Bregma에 시작점으로 배치합니다. Bregma에서 2mm 후방으로 이동하고 내측 봉합사로 측면으로 ~2.4mm 이동합니다.
5. 이 위치에서 카테터를 위한 0.5mm 직경의 구멍을 뚫습니다. 뼈 가루를 부드럽게 불어냅니다.
   참고: 드릴링 중에 경막이 손상되지 않은 상태로 유지되는 것이 중요합니다. 이를 위해 1) 정위 프레임에 설치할 수 있는 드릴을 사용하고, 2) 드릴링 중에 구멍을 자주 검사하고, 3) 작은 단계로 드릴다운합니다. 두개골에 너무 많은 압력이 가해지면 드릴 팁이 두개골로 계속 들어가 두개골이 완전히 관통되었을 때 뇌를 손상시킵니다.
6. 첫 번째 구멍에서 몇 밀리미터 떨어진 곳에 앵커 나사용 구멍 3개(직경 ~1.3mm)를 추가로 뚫습니다. 뼛가루를 부드럽게 불어냅니다.
   알림: 카테터 상단(직경 ~2mm)과 앵커 나사 상단(~1mm)에 충분한 공간을 제공하는 앵커 나사 위치를 선택하십시오.
7. 주사기를 사용하여 약 1 - 2 mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 생리식 식염수를 세척하여 뼈 먼지를 제거합니다. 두개골을 청소하십시오. 앵커 나사를 2 - 3바퀴 완전히 조입니다.
   알림: 앵커 나사는 치과용 시멘트와 카테터를 제자리에 고정하여 설정을 안정화하는 데 필요합니다. 앵커 나사를 조이는 동안 집게로 부드럽게 위로 들어 올려 쉽게 분리되지 않도록 하십시오. 카테터를 삽입하는 것 자체가 조직 외상을 유발하기 때문에 앵커 나사를 드릴링하거나 조이는 동안 추가적인 경막 손상은 다발성 외상으로 이어질 수 있으며 그룹 내 비교를 방해할 수 있습니다. 앵커 나사를 먼저 조이고 카테터를 마지막에 삽입합니다.
8. 두개골 표면에 수직인 첫 번째 구멍을 통해 2mm 길이의 카테터를 삽입합니다. 카테터를 잡고 있는 동안 약간의 치과용 시멘트를 바르고 치과 경화광에 짧게(~5초) 노출시켜 카테터를 안정화하여 다음 단계에서 양손을 사용할 수 있도록 합니다.
   주의: 치과 경화 조명으로 작업하는 동안 이 빛의 높은 강도로 인해 망막 손상이 발생할 수 있으므로 팁이나 적용 영역에서 반사된 빛을 직접 마십시오. 적절한 보호 고글을 사용하십시오.
9. 카테터 주위에 치과용 시멘트를 더 바르고, 나사를 고정하고, 치과 경화광(~15 - 30초)으로 치과용 시멘트를 응고시킵니다. 집게 끝으로 시멘트의 경화를 확인하십시오.

4. 상처의 봉합과 마취의 적대

감

1. 재흡수성 봉합사로 머리 피부를 닫고, 카테터의 전방과 후방을 닫습니다.
   참고: 이식 끝에 두개골 위에 울퉁불퉁한 설정이 있을 것이므로 그에 따라 상처 봉합을 수행합니다. 피부를 너무 많이 들어 올리면 동물에게 불편함을 줄 수 있습니다.
2. 1mL 주사기와 26G 바늘을 사용하여 해독제 혼합물을 피하주사(체중 1.5mL/kg)합니다.
3. 예방적 항생제 치료를 위해 피하주사(체중 7.5mg/kg)로 엔로플록사신(2.5%)을 투여합니다. 피하 주사로 통증 완화를 위해 카프로펜(1mg/mL, 체중 5mg/kg)과 부프레노르핀(1.2mg/kg)을 투여합니다.

5. 수술 후 관리 및 약물 치료

1. 동물을 개조된 우리로 되돌려 놓고 저체온증을 피하기 위해 적외선을 사용하여 1-3시간 동안 관찰하십시오.수술 후 회복될 때까지 5-10분마다 동물을 지속적으로 관찰하고 위치를 변경합니다. 회복될 때까지 눈에 지속적으로 빛이 노출되지 않도록 각별히 주의하십시오.
2. 수술 다음날 피하 주사로 엔로플록사신(체중 7.5mg/kg)과 카프로펜(체중 5mg/kg)을 반복한다. 부프레노르핀은 이전 치료법이 72시간 동안 효과적이므로 새로 고칠 필요가 없습니다.

6. 면역 혼합물의 준비 (카테터 이식 후 빠르면 14 일)

참고: 준비 과정에서 주사기를 얼음 위에 올려 놓습니다.

1. 10mL Luer 잠금 팁 유리 주사기 2개를 3방향 스톱콕의 짧은 암에 연결하고 긴 암으로 세 번째 배출구를 닫습니다.
2. 연결부가 안전하고 누출이 없는지 확인: 피스톤 2를 잡고 열린 주사기에 약 4mL의 멸균 PBS를 추가합니다. 피스톤 1을 삽입하고 누출 여부를 확인하면서 두 피스톤을 앞뒤로 밉니다. 누출이 발생하지 않으면 PBS를 폐기하고 피스톤 1을 다시 제거하십시오.
3. 불완전 프로인트 보조제(IFA) 1mL와 재조합 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(rMOG_1-125) 50μg을 함께 피펫팅하고 적절한 튜브에서 멸균 PBS(pH 7.4)와 함께 혼합물을 최종 부피 2mL로 조정합니다.
   참고: 준비하는 동안 주사기의 끝이나 벽에 있는 에멀젼이 손실되기 때문에 투여용으로 의도된 것보다 더 많은 양을 준비하십시오. 한 번에 1마리 이상의 동물을 준비하는 것도 마찬가지로 더 실용적입니다.
4. 희석된 IFA와 rMOG_1-125 혼합물을 개방형 주사기에 넣습니다. 반대쪽 피스톤에 느슨한 압력을 유지하면서 피스톤을 부드럽게 삽입합니다(그림 3A).
5. 하얗고 점성이 생길 때까지 피스톤을 앞뒤로 밀어 한 주사기에서 다른 주사기로 접종물을 밀어 접종물을 유화합니다(그림 3B).
6. 1mL Luer Lock 주사기를 3방향 마개의 열린 짧은 암에 고정하고 접종물로 채웁니다(그림 3C). 모든 접종물을 1mL 주사기에 분배합니다. 주사할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 준비 당일에 혼합물을 투여하십시오.

7. 예방 접종

1. 챔버에서 이소플루란으로 쥐를 마취한 후(~2분, 산소 2L/분과 혼합) 마스크(산소 1.5L/분과 혼합)를 통해 마취를 지속합니다.
2. 21G 바늘을 사용하여 꼬리 베이스에 200μL의 접종물을 피하로 주입합니다.
   참고: 용액이 점성이 있으므로 주입을 천천히 투여하십시오.

8. 뇌내 사이토카인 주사

1. 커넥터 캐뉼러의 길이(2mm)를 조정합니다. (준비 단계는 그림 4를 참조하십시오.)
2. 1mL 주사기에 사이토카인 혼합물(500ng/μL의 종양괴사인자-알파(TNF-alpha), 300U/μL의 재조합 랫드 인터페론-감마(IFN-gamma)를 멸균 PBS에 채웁니다. 주사기를 커넥터 캐뉼러에 연결합니다. 캐뉼러에 사이토카인 혼합물을 채웁니다. 거품을 피하십시오.
3. 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 주사기를 장착하고 0.2μL/분을 주입하도록 프로그래밍합니다(그림 5A). 캐뉼라 끝에 기포가 형성되는 것을 방지하기 위해 펌프를 시작하고 계속 작동시키십시오.
   참고: 사출 속도는 사용된 특정 주사기의 내경을 고려해야 합니다. 따라서 펌프 설정 중에 주사기 직경을 등록해야 합니다.
4. 챔버에서 이소플루란으로 쥐를 마취한 다음(~2분, 2L/분의 산소와 혼합) 마스크(1.5L/분의 산소와 혼합)를 통해 마취를 지속합니다(그림 5B 및 5C).동물이 최소 30분 동안 마취될 것이므로 윤활 안약을 바르십시오.
5. 주입구로 카테터 캡을 제거합니다. 커넥터 캐뉼러를 카테터에 삽입하고 나사로 조이고 조입니다(그림 5D 및 5E).
   알림: 카테터의 상단 끝이 파손될 수 있으므로 과도하게 조이지 마십시오.
6. 주입이 10분 동안 진행되도록 합니다(총 주입량은 2μL). 펌프를 멈춥니다. 주입된 부피가 완전히 확산될 수 있도록 카테터 내부의 캐뉼러를 20분 동안 그대로 두십시오.
7. 커넥터 캐뉼라의 나사를 풀고 진공 효과를 피하기 위해 천천히 제거하십시오.
8. 카테터 캡을 주입구에 다시 부착하고 나사로 조입니다. 동물이 케이지에서 마취에서 회복할 때까지 기다립니다.

결과

그림 1: 카테터 준비. (A 및 B) 가이드 캐뉼라와 더미 캐뉼라(흡입구가 있는 카테터 캡)가 조립되고 나사로 고정됩니다. (C) 그런 다음 메스를 사용하여 카테터를 2mm 크기로 자릅니다. 현미경 관찰에 따르면 이러한 목적으로 가위를 사용하면 캐뉼라 팁의 원형 모양이 왜곡되므로 피해야 합니다.

그림 2: 카테터의 이식. (A) 수술은 세로...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
성인 수컷 Dark Agouti 쥐 (300 ±25g)
펜타닐	Hameln pharma plus, 독일		펜타닐-시트레이트로서, 50 μg/ml
미다졸람	ERWO Pharma, 오스트리아	50039017	5 mg/ml
메데토미딘	Orion Pharma, 핀란드		메데토미딘 염산염으로서, 1mg/ml
플루마제닐	Roche, 스위스		0.1 밀리그램 / 밀리람베르트
아티파메졸	Orion Pharma, 핀란드		아티파메졸 염산염으로서, 5 mg/ml
10% 포비돈-요오드 복합체	Mundipharma, 오스트리아
치과 용 시멘트	Heraeus Kulzer, 독일	6603 7633
생리식염수	Fresenius Kabi, 오스트리아		0.9% 염화나트륨
인산염 완충 식염수(PBS)	Sigma-Aldrich, 독일	P3813
이소플루오란	AbbVie, 오스트리아
윤활 안약	Thea Pharma, 오스트리아
70% EtOH	Merck, 독일	1070172511	앱솔루트 에탄올을 70% v/v의 제조를 위해 ddH2O에 희석하였다
2.5% 엔로플록사신	Bayer, 독일		예방적 항생제
카르프로펜	화이자, 미국		진통제, 50mg/ml
트윈-20	Sigma-Aldrich, 독일	P9416
펜토바르비탈	Richter Pharma, 오스트리아		펜토바르비탈 나트륨, 400mg/ml
인터페론 감마	PeproTech, 미국	400-20
종양 괴사 인자 알파	R&D Systems, 미국	510-RT-050/CF
rMOG1-125	스웨덴 Karolinska Institute의 Centre of Molecular Medicine에서 자체 제품		재조합 랫트 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, N-말단의 아미노산 1-125, 상업적으로도 이용 가능: AnaSpec, AS-55152-500, USA
불완전한 프로인트 보조제	Sigma-Aldrich, 독일	F5506
소 혈청 알부민	Sigma-Aldrich, 독일	A9576
Peroxidase 기질 용액	Vector Laboratories, 미국	SK-45000
Stereotactic 프레임	David Kopf Instruments, 미국
카테터, MRI 적합	PlasticsOne, 미국	8IC315GPKXXC
더미 캐뉼러	PlasticsOne, 미국	8IC315DCNSPC
플라스틱 나사, MRI 적합	PlasticsOne, 미국	8L080X093N01
커넥터 캐뉼러	PlasticsOne, 미국	8IC313CXSPCC
2mm 팁 크기의 스크류 드라이버
유연한 샤프트 익스텐션을 통한 드릴	Proxxon, 독일	28 472 번, 28 706 번, 28 620 번,
드릴 비트, 원형, 0.5 mm	Hager & Meisinger, 독일	레프310 104 001 001 009
드릴 비트, 꼬임, 1.3 mm	Hager & Meisinger, 독일	레프350 104 417 364 013
메스	Braun, 독일	비비510
메스 손잡이	Fine Science Tools, 독일	91003-12
코튼 팁 어플리케이터	Henry Schein Medical, 오스트리아	900-3155
수술용 가위	Fine Science Tools, 독일	14101-14, 14088-10
수술용 겸자	Fine Science Tools, 독일	11002-12, 11251-35
불독 클램프	Fine Science Tools, 독일	18050-35
동종발열 담요	TSE 시스템, 독일
적외선 램프	Beurer, 독일	616.51
치과 경화 광	계림 딱따구리 의료, 중국
흡수성 봉합사	Johnson & Johnson, 벨기에	V792E는
프로그래밍 가능한 주사기 펌프	World Precision Instruments, 미국	알-1000
시험 장갑
수술 가운
전기면도기	Aesculap, 독일	GT420
휘발성 마취 기화기	Rothacher Medical, 스위스	이력서 30-301-D
휘발성 마취 기화기용 산소 공급원	Air Liquide, 오스트리아	19,113
휘발성 마취실	Rothacher Medical, 스위스	PS-0347
쥐를 위한 마취 마스크	Rothacher Medical, 스위스	PS-0307-A
주사기 1ml	Codan, 덴마크	참조 62.1612
주입을 위한 26 계기 바늘	Braun, 독일	4657683
사이토카인 주사 및 면역을 위한 20 게이지 바늘	Braun, 독일	4657519
루어 락 팁 유리 주사기	Poulten & Graf, 독일	7.140-37
3방향 마개	Becton Dickinson, 스웨덴	394600
37°C 인큐베이터	Kendro, 독일	50042301
마이크로피펫	Gilson, 미국	F167350