CRISPR Cas9을 이용한 자연살해세포의 유전자 편집 기법

초록

출처: Naeimi Kararoudi, M., et al. Cas9 리보핵단백질을 이용한 녹아웃 1차 및 확장 인간 NK 세포 생성. J. Vis. 특급. (2018).

이 비디오는 1차 자연살해(NK) 세포의 Cas9 리보핵단백질 매개 유전자 변형 기술을 보여줍니다. CRISPR RNA(crRNA)와 trans-activating crRNA(tracrRNA)를 염기쌍으로 하여 형성된 가이드 RNA(gRNA)에 결합된 Cas9 엔도뉴클레아제로 구성된 Cas9 리보핵단백질은 전기천공법을 통해 1차 자연살해세포에 도입됩니다. 리보핵단백질은 표적 부위에서 숙주 DNA를 표적화하고 절단하여 세포 복구 기계를 통한 표적 유전자의 변형을 통해 유전자 녹아웃을 유도합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 인간 NK 세포 정제 및 증식

1. Buffy Coat에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리합니다.
   1. 35mL의 버피 코트 샘플을 15mL의 Ficoll-Paque에 레이어
   링합니다.
   2. 브레이크 없이 400 x g에서 20분 동안 원심분리기를 사용하고 인터페이스에서 PBMC를 수집합니다.
   3. 회수된 PBMC를 동일한 부피 이상의 PBS를 첨가하고 400 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 PBC 세척을 흡인하여 3회 세척합니다. NK cell은 이 단계에서 RosettesSep에 의해 분리될 수 있습니다.
2. 0일, 7일, 14일에 방사선 조사된 10 x 10⁶ mbIL21 발현 공급세포를 자극하여 NK 세포를 확장한다. 격일로 전체 배지 용량에 대해 10% FBS, 1% 글루타민, 1% 페니실린 스트렙토마이신 및 100IU/mL의 IL-2를 함유한 새로운 RPMI로 배지를 교체합니다.

2. gRNA 설계 및 선택

1. 온라인 도구(예: NCBI, Ensemble.
   )를 사용하여 표적화할 특정 게놈 유전자좌를 선택합니다. 본보기.
   기술: 변형 성장 인자 베타 수용체 2 (TGFBRR2) ectodomain
   기록보기 : PF08917
   InterPro 보기: IPR015013
   위치: 49 - 157 aa
   표적 염기서열: TGFBR2 유전자의 엑손 4(ENSG00000163513)
2. gRNA를 설계하려면 http://crispr.mit.edu 및 'Benchling'과 같은 CRISPR 디자인 웹 도구를 사용하십시오.
   1. 2.1단계에서 선택한 DNA 염기서열을 입력합니다. human(hg 19)을 표적 게놈으로 선택합니다. CRISPR 가이드(20개의 뉴클레오티드 다음에 PAM(protospacer adjacent motif) 염기서열: NGG)이 이전에 입력된 염기서열에서 스캔됩니다. 또한 선택한 게놈 전체에서 가능한 off-target 일치를 보여줍니다.
   2. on-target 및 off-target 비율에 따라 점수가 가장 높은 상위 3개의 gRNA를 선택합니다. 예를 들어, 표 1은 CRISPR 설계 웹 도구에서 제안한 TGFBR2 유전자의 엑손 4를 표적으로 하도록 설계된 CRISPR RNA를 보여줍니다.
3. CRISPR RNA를 합성 염기서열 특이적 crRNA로 주문합니다.
4. 보존된 transactivating RNA(tracrRNA)를 주문하여 crRNA와 부분 상동성을 통해 상호 작용합니다.

3. 디자인 삭제 스크리닝 프라이머

1. T7E1 돌연변이 분석을 위한 gRNA 절단 부위에 걸친 설계 프라이머.
2. 돌연변이 분석 후 1.5% 아가로스 겔에 sgRNA 표적 부위의 작은 insertion-deletion(indels)이 나타나도록 하기 위해 예측된 cleavage site에서 최소 100bp 떨어진 곳에 primer를 사용하십시오. 표 2는 TGFBR2 엑토도메인을 증폭하는 데 사용되는 프라이머를 보여줍니다.

4. 인간 1차 및 확장 NK 세포의 형질도입

참고: Cas9/RNP 원소를 NK로 변환하는 것은 다음과 같이 4D 시스템을 사용한 전기천공법에 의해 수행됩니다.

1. 세포 준비
   1. 1차 NK 세포의 경우, 100 IU/mL의 IL-2가 있는 상태에서 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지에서 갓 분리한 NK 세포를 4일 동안 배양하고 5일째에 전기천공을 수행합니다. 앞에서 설명한 대로 격일로 미디어를 교체하고 이식 전날에 미디어를 교체하십시오.
   2. 팽창된 NK cell의 경우, 조사된 feeder cell로 0일차에 1:1의 비율로 세포를 자극하고 5일차, 6일차 또는 7일차에 전기천공을 시행합니다. 앞에서 설명한 대로 격일로 미디어를 교체하고 이식 전날에 미디어를 교체하십시오.
   3. 전기천공법 당일, 전기천공을 받는 세포를 위해 100IU/mL의 IL-2가 함유된 새로운 RPMI 8mL로 채워진 T25 플라스크를 준비하고 가습된 37°C 및 5% CO₂ 인큐베이터에서 플라스크를 사전 배양합니다.
      메모: 해동된 세포 또는 2차 또는 3차 자극을 받은 세포는 설명된 대로 회복 후 언제든지 전기천공할 수 있습니다.
   4. 26 μL의 형질도입 믹스에 대해 조건당 3 - 4 × 10⁶ 세포를 취합니다.
      메모: 전기천공법(electroporation solution)에 농도가 매우 높은 NK cell은 transduction rate를 향상시킵니다.
   5. PBS로 세포를 3회 세척하여 일반적으로 RNase 활성을 포함하는 모든 FBS를 제거합니다. 8분 동안 매번 300 x g으로 스핀다운합니다.
      메모: 단일 gRNA(gRNA1, gRNA2, gRNA3) 및 두 개의 gRNA(gRNA1+gRNA2, gRNA1+gRNA3, gRNA2+gRNA3)의 조합 및 Cas9/RNP가 없는 하나의 대조군으로 Cas/RNP에 대한 7가지 전기천공 조건을 고려합니다.
2. crRNA:tracerRNA/complex 형성
   1. crRNA(gRNA1, gRNA2 및 gRNA3) 및 tracerRNA를 1x TE 용액에서 최종 농도 200μM까지 재현탁합니다.표 3과 같이 각 200μM gRNA 2.2μL를 200μM tracerRNA와 혼합합니다.
   2. 샘플을 95°C에서 5분 동안 가열하고 벤치 탑에서 실온(15 - 25°C)으로 냉각시킵니다. 나중에 사용할 수 있도록 재현탁된 RNA 및 crRNA: tracrRNA/복합체를 -20°C에서 보관하십시오.
3. RNP 복합체 형성
   참고: 시간을 절약하려면 세척 단계 4.1.5 중에 RNP 복합체를 형성하십시오.
   1. 단일 crRNA:tracrRNA 이중 반응의 경우, 표 4의 실시예와 같이 Cas9 엔도뉴클레아제를 36μM로 희석합니다.
   2. crRNA:tracrRNA duplexes의 조합 transduction을 위해 표 5의 예와 같이 Cas9 endonuclease를 36μM로 희석합니다.
   3. crRNA에 Cas9 엔도뉴클레아제를 추가합니다:tracrRNA 듀플렉스를 30초에서 1분에 걸쳐 피펫 팁을 소용돌이치면서 천천히 듀플렉스합니다.
   4. 혼합물을 실온에서 15 - 20 분 동안 배양합니다. 배양 후 혼합물을 사용할 준비가 되지 않은 경우 사용할 때까지 혼합물을 얼음에 보관하십시오.
4. 전기충격법
   1. 전체 보충제를 전기천공법 용액 P3에 넣고 실온에 보관하십시오.
   2. 세포 펠릿(단계 4.1.5의 세포 3 - 4 × 10⁶개 세포)을 20μL의 P3 1차 4D 전기천공액에 재현탁합니다. 피펫팅하는 동안 기포를 피하십시오.
      참고 : 세포를 P3 용액에 오랫동안 두어서는 안됩니다.
   3. 즉시 5μL의 RNP 복합체를 세포 현탁액에 첨가합니다(단계 4.3).
   4. 1 μL의 100 μM Cas9 전기천공법 인핸서를 Cas9/RNP/셀 혼합물에 추가합니다.
   5. Cas9/RNP/세포 혼합물을 20μL 전기천공법 스트립으로 옮깁니다.
   6. 스트립을 부드럽게 두드려 샘플이 스트립의 바닥을 덮는지 확인합니다.
   7. 4D electroporation 체계를 시작하고 EN-138 프로그램을 선택하십시오.

표 1. TGFBR2 엑토도메인의 엑손 4를 합성 crRNA로 표적으로 하는 3개의 설계된 gRNA.

gRNA 번호	gRNA 염기서열	합성 crRNA로 주문됨
gRNA1	5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3	/AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrUrUrUrGrCrUrGrCrU/AltR2/
gRNA2	5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3	/AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrGrCrUrUrUrUrUrUrGrGrCrUrUrUrGrCrUrUrGrCrU/AltR2/
gRNA3	5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3	/AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrA rGrArG rCrUrUrA rUrGrCrU/AltR2/

표 2. TGFBR2 ectodomain 유전자를 증폭하는 데 사용되는 프라이머

TGFBR 2 엑토도메인 프라이머 FWD	5 GTC TGC TCC 집계 TGA TGT TTA T3
TGFBR2 엑토도메인 프라이머 REV	5 GGG CCT 개그 AAT CTG 고양이 TTA 3

표 3. 200 μM RNA를 사용하여 crRNA:tracrRNA/복합체를 형성합니다.

분

구성 요소	금액(uL)
200 μM crRNA	2.2
200μM 추적자 RNA	2.2
IDTE 버퍼	5.6
최종 제품	10

표 4. 단일 crRNA:tracrRNA 이중 반응의 경우 Cas9 엔도뉴클레아제를 36μM로 희석합니다.

개 개

구성 요소	양(μL)
PBS (PBS)	1
crRNA:tracrRNA 듀플렉스(4.2단계부터)	2 (200 pmol)
Alt-R Cas9 엔도뉴클레아제(61μM 스톡)	2
총 부피	5 ul

표 5. crRNA의 조합 transduction을 위해:tracrRNA duplexes는 Cas9 endonuclease를 36 μM로 희석합니다.

개 개

구성 요소	양(μL)
PBS (PBS)	1
crRNA:tracrRNA duplex (예: gRNA1)	1 (100 pmol)
crRNA:tracrRNA duplex (예: gRNA2)	1 (100 pmol)
Alt-R Cas9 엔도뉴클레아제	2
총 부피	5 μL

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RosetteSep™ 인간 NK 세포 농축 칵테일	스템셀 테크놀로지스	15065	RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail은 음성 선택에 의해 전혈에서 NK 세포를 분리하도록 설계되었습니다.
Ficoll-Paque® 플러스	GE Healthcare - 생명	Tel.: 17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	통합 DNA 기술	1072532	TracrRNA는 뉴클레아제 저항성을 증가시키는 독점적인 화학적 변형을 포함합니다. crRNA로 혼성화하여 Cas9 효소를 활성화합니다.
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA	통합 DNA 기술		내륙 유전자를 표적으로 하는 설계된 gRNA의 염기서열을 기반으로 Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA로 합성 생산
Alt-R® 게놈 편집 검출 키트	통합 DNA 기술	1075931	각 키트에는 T7EI 엔도뉴클레아제, T7EI 반응 완충액 및 T7EI 분석 대조군이 포함되어 있습니다.
Platinum® Taq DNA 중합효소 고충실도	인비트로젠	제11304-011
4D-Nucleofector™ 시스템	론자	AAF-1002B
인간 재조합 IL-2 단백질	노바티스	우편번호 65483-0116-07
P3 일차 세포 4D-Nucleofector™ X 키트	론자	V4XP-3032	pmaxGFP™ 벡터, Nucleofector™ 용액, 보충제, 16웰 뉴클레오큐벳™ 스트립 함유
비표적화: 맞춤형 siRNA, 표준 0.05 2mol ON-TARGETplus	다르마콘	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 뉴클레아제 3NLS	통합 DNA 기술	1074181	Cas9 뉴클레아제
DNeasy® 혈액 및 조직 핸드북	키아겐	69504
RNeasy 미니 키트	키아겐	74104
칼세인 AM	써모피셔	C3099 (영문
티지에프β	바이오레전드	580706
Alt-R® CRISPR-Cas9 제어 키트, 인간	통합 DNA 기술	1072554	tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix 및 Nuclease-Free Duplex Buffer를 포함합니다.
IDTE pH 7.5 (1X TE 용액)	통합 DNA 기술	11-01-02-02
Alt-R® Cas9 Electroporation 인핸서	통합 DNA 기술	1075915	Cas9 Electroporation 인핸서

년 과학 호 시리즈 년 )