CRISPR Cas9을 이용한 자연살해세포의 유전자 편집 기법

초록

출처: Naeimi Kararoudi, M., et al. Cas9 리보핵단백질을 이용한 녹아웃 1차 및 확장 인간 NK 세포 생성. J. Vis. 특급. (2018).

이 비디오는 1차 자연살해(NK) 세포의 Cas9 리보핵단백질 매개 유전자 변형 기술을 보여줍니다. CRISPR RNA(crRNA)와 trans-activating crRNA(tracrRNA)를 염기쌍으로 하여 형성된 가이드 RNA(gRNA)에 결합된 Cas9 엔도뉴클레아제로 구성된 Cas9 리보핵단백질은 전기천공법을 통해 1차 자연살해세포에 도입됩니다. 리보핵단백질은 표적 부위에서 숙주 DNA를 표적화하고 절단하여 세포 복구 기계를 통한 표적 유전자의 변형을 통해 유전자 녹아웃을 유도합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 인간 NK 세포 정제 및 증식

1. Buffy Coat에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리합니다.
   1. 35mL의 버피 코트 샘플을 15mL의 Ficoll-Paque에 레이어
   링합니다.
   2. 브레이크 없이 400 x g에서 20분 동안 원심분리기를 사용하고 인터페이스에서 PBMC를 수집합니다.
   3. 회수된 PBMC를 동일한 부피 이상의 PBS를 첨가하고 400 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 PBC 세척을 흡인하여 3회 세척합니다. NK cell은 이 단계에서 RosettesSep에 의해 분리될 수 있습니다.
2. 0일, 7일, 14일에 방사선 조사된 10 x 10⁶ mbIL21 발현 공급세포를 자극하여 NK 세포를 확장한다. 격일로 전체 배지 용량에 대해 10% FBS, 1% 글루타민, 1% 페니실린 스트렙토마이신 및 100IU/mL의 IL-2를 함유한 새로운 RPMI로 배지를 교체합니다.

2. gRNA 설계 및 선택....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RosetteSep™ 인간 NK 세포 농축 칵테일	스템셀 테크놀로지스	15065	RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail은 음성 선택에 의해 전혈에서 NK 세포를 분리하도록 설계되었습니다.
Ficoll-Paque® 플러스	GE Healthcare - 생명	Tel.: 17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	통합 DNA 기술	1072532	TracrRNA는 뉴클레아제 저항성을 증가시키는 독점적인 화학적 변형을 포함합니다. crRNA로 혼성화하여 Cas9 효소를 활성화합니다.
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA	통합 DNA 기술		내륙 유전자를 표적으로 하는 설계된 gRNA의 염기서열을 기반으로 Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA로 합성 생산
Alt-R® 게놈 편집 검출 키트	통합 DNA 기술	1075931	각 키트에는 T7EI 엔도뉴클레아제, T7EI 반응 완충액 및 T7EI 분석 대조군이 포함되어 있습니다.
Platinum® Taq DNA 중합효소 고충실도	인비트로젠	제11304-011
4D-Nucleofector™ 시스템	론자	AAF-1002B
인간 재조합 IL-2 단백질	노바티스	우편번호 65483-0116-07
P3 일차 세포 4D-Nucleofector™ X 키트	론자	V4XP-3032	pmaxGFP™ 벡터, Nucleofector™ 용액, 보충제, 16웰 뉴클레오큐벳™ 스트립 함유
비표적화: 맞춤형 siRNA, 표준 0.05 2mol ON-TARGETplus	다르마콘	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 뉴클레아제 3NLS	통합 DNA 기술	1074181	Cas9 뉴클레아제
DNeasy® 혈액 및 조직 핸드북	키아겐	69504
RNeasy 미니 키트	키아겐	74104
칼세인 AM	써모피셔	C3099 (영문
티지에프β	바이오레전드	580706
Alt-R® CRISPR-Cas9 제어 키트, 인간	통합 DNA 기술	1072554	tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix 및 Nuclease-Free Duplex Buffer를 포함합니다.
IDTE pH 7.5 (1X TE 용액)	통합 DNA 기술	11-01-02-02
Alt-R® Cas9 Electroporation 인핸서	통합 DNA 기술	1075915	Cas9 Electroporation 인핸서

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