백신을 위한 재조합 생독감 인플루엔자 바이러스 생성

Abstract

출처: Pérez-Girón, J. V. et al, 점막 면역을 연구하기 위한 키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 내 투여.J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 한랭 적응 재조합 인플루엔자 바이러스를 만드는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 인간 세포를 양방향 플라스미드로 형질주입한 후 저온 배양에서 배양하여 백신 생산에 적합한 바이러스를 생성하며, 따뜻한 조건에서 복제가 감소하는 것이 특징입니다.

Protocol

1. 역유전학에 의한 재조합 약독화 인플루엔자 백신 생성

참고: 역유전학에 의한 재조합 인플루엔자 바이러스 생성에 대한 자세한 프로토콜은 이전 연구에서 설명되었으며 이 보고서의 범위를 벗어납니다. 간단히 말해서, 한랭 적응 인플루엔자 백신(CAV)의 구출은 생물안전 레벨 2(BSL2) 격납 하의 생물안전 등급 II 캐비닛에서 수행되며 아래에 설명된 단계가 포함됩니다.

1. A/PR/8/34(H1N1) 균주의 저온 적응 균주 A/Ann Arbor/6/60(H2N2)과 헤마글루티닌(HA) 및 변형된 뉴라미니다아제(NA)를 배경으로 사용하여 재조합 한한 인플루엔자 백신을 생성합니다(그림 1A). NA 유전자의 변형은 단백질 줄기(잔기 65 내지 72)의 보존된 염기서열(잔기 65 내지 72)을 닭고기 오브알부민(OVA) 유래 펩타이드 SIINFEKL을 암호화하는 짧은 cDNA 염기서열에 의한 PCR 기반 대체로 구성됩니다(그림 1B). SIINFEKL 펩타이드는 C57BL/6 마우스의 H-2b MHC 클래스 I 제한 반응과 관련하여 매우 면역 우성 펩타이드입니다.
2. 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/E)이 보충된 DMEM 10% 소 태아 혈청(FBS)을 사용하여 6웰 플레이트의 웰당 플레이트^{10 6} 293T 세포.
3. 플라스미드 형질주입 혼합물 준비: 인플루엔자 A/Ann Arbor/6/60 균주에서 PB2, PB1, PA, NP, M, NS를 인코딩하는 cDNA를 각각 1μg씩 추가하고, 인플루엔자 A/PR/8/34에서 NA-SIINFEKL 및 HA를 인코딩하는 플라스미드 1μg을 추가합니다. 예열된 Opti-minimal essential medium(Opti-MEM)을 추가합니다(100μl/well의 최종 부피에 대해 15μl).
4. RT에서 30분 동안 transfection mix를 배양합니다.
5. 100μl의 형질주입 믹스/웰을 추가하고 37°C 및 5% CO₂에서 16시간 동안 배양합니다.
6. DMEM 0.3% BSA, 33°C에서 1% P/E 및 5% CO₂로 5시간 동안 세포 배지를 변경합니다.
7. ^L-1-토실아미드-2-페닐에틸 클로로메틸 케톤(TPCK-트립신)으로 처리된 소 췌장에서 추출한 1μg/ml의 트립신을 함유한 디메틸설폭사이드(DMSO)에 10 6 인플루엔자 허용 Madin-Darby Canine Kidney(MDCK) 세포를 추가합니다. 293T-MDCK 공동 배양을 33 ° C 및 5 % CO₂에서 2-3 일 동안 유지하십시오.
8. MDCK-293T 세포 공동 배양의 상층액을 수집하고 260 x g에서 5분 동안 원심분리하여 투명화합니다.

Results

그림 1. 추적 가능한 LAIV의 엔지니어링.(A) ambisense 플라스미드에서 클로닝된 인플루엔자 분절은 Lipofectamine 2000을 사용하여 293T 세포로 transfection되었습니다. 형질주입 24시간 후, 293T 세포에서 얻은 상등액을 사용하여 1%의 TPCK 트립신이 존재하는 상태에서 인플루엔자 허용 Madin-Darby 개 신장(MDCK) 세포를 코팅했습니다. 모든 프로토콜은 33°C에서 수행되었으며, MDCK 세포의 바이러스 상등액을 33°C에서 3일 동안 9일 된 배아 계란에 접종했습니다. PCR 기반 바이러스 게놈 증폭 및 염기서열분석을 통해 바이러스 구조를 확인했습니다. (B) 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA)에 OVA 유래 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
둘베코의 변형 이글 미디엄 (DMEM 1X)	Gibco RL-Life 기술	41965-039
옵티멜	Gibco RL-Life 기술	31985-047
리포펙타민 2000	Invitrogen-Life 기술	11668-027
페니실린-스트렙토마이신(10.000 U/ml)	파아	11-010
소 세럼 알부민	시그마-알드리치	A2153
디메틸-설폭사이드(DMSO)	시그마-알드리치	D2650
트립신-TPCK	시그마-알드리치	T1426