종양 스페로이드에 침투하는 T 세포의 3차원 공동 배양 모델

초록

출처: Lin, Y., et al. 3D 배양에서 암세포 침입 및 T 세포 독성 모니터링. J. Vis. 특급 (2020).

이 동영상은 3차원 종양 스페로이드와 T 세포 공동 배양을 확립하는 방법을 보여줍니다. 종양 스페로이드를 함유하는 마이크로웰이 있는 아가로스 캐스트를 준비한 후 T 세포를 첨가합니다. 배양 후 이 설정을 통해 통제된 3차원 환경에서 T 세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

1. 스페로이드의 생성

1. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에서 2% 아가로스를 준비 및 오토클레이브(예: 1x PBS 50mL에 1g 아가로스) 및 35-및 81-마이크로웰 고무 금형을 오토클레이브합니다.
   주의: 면역조직화학(IHC) 처리를 위한 아가로스 캐스트를 생성하기 위해 저융점 아가로스를 사용하지 마십시오.
2. 아가로스 캐스트 준비
   참고: 35-마이크로웰 캐스트는 침입, 면역형광(IF) 및 세포 분리 분석에 사용됩니다. 81-마이크로웰 캐스트는 세포 독성, IHC, 세포 분리 및 리보 핵산(RNA) 추출 분석에 사용됩니다.
   1. 아가로스를 고압증기멸균한 후 용융된 아가로스를 약 60°C로 냉각시킵니다. 세포 배양 후드에서 무균 기법을 사용하고 웰당 81-마이크로웰 고무 몰드에 용융된 아가로스 500μL를 피펫으로 넣거나 웰당 35-마이크로웰 고무 몰드에 330μL를 피펫으로 넣습니다.
      주의: 아가로스를 혼합하거나 피펫팅하는 동안 기포가 생기지 않도록 하십시오. 부드럽게 피펫팅하여 기포를 제거합니다.
   2. 아가로스가 응고된 후 고무 몰드를 조심스럽게 구부려 아가로스 캐스트를 제거합니다. 이로써 적절한 웰 플레이트 위에 손을 놓고 아가로스 캐스트가 웰 플레이트의 한 웰에 바로 떨어지도록 합니다.
      메모: 과도하게 구부러지는 것을 방지하기 위해 다른 위치에서 고무 몰드를 구부립니다. 고무 몰드를 구부리면서 동시에 바닥에서 부드럽게 밀어 넣는 것이 도움이 될 수 있습니다.
   3. 아가로스 캐스트를 평형화하기 위해 10% 소 태아 혈청(12웰 플레이트의 경우 2.5mL/웰, 24웰 플레이트의 경우 1mL/웰)이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)으로 구성된 세포 배양 배지를 추가합니다. 웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 넣고 1시간 동안 배양합니다.
3. 한편, seeding.
   을 위한 세포 배양을 준비합니다. 메모: 아가로스 캐스트당 총 세포 파종 수는 연구자가 결정합니다. 쥐 원발성 췌장암 세포주의 경우, 35,000 cells/35-microwell cast 및 81,000 cells/81-microwell cast(평균 1000 cells/spheroids)를 seeding합니다. 스페로이드의 평균 직경은 48시간 후 약 150\u2012200μm입니다.
4. 먼저 웰 플레이트를 기울여 P1000 피펫으로 주조된 아가로스 주위를 둘러싼 세포 배양 배지를 제거합니다. 그런 다음 파종 챔버에서 배지를 조심스럽게 제거합니다.
5. 준비된 종양 세포 현탁액을 세포 파종 챔버에 적방울 방향으로 조심스럽게 파종합니다. 웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 15분 동안 조심스럽게 다시 넣습니다.
   메모: 이 단계에서 세포는 아가로스 캐스트의 마이크로웰에 정착합니다.
6. 아가로스 캐스트 외부에 배지를 추가합니다(12웰 플레이트의 경우 2.5mL/웰, 24웰 플레이트의 경우 1mL/웰).
7. 웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 48시간 동안 다시 넣습니다< /> 메모: 일반적으로 세포가 마이크로웰에서 스페로이드를 형성하는 데 최대 몇 시간이 걸립니다. 일반적으로 고형 종양 세포 스페로이드는 24시간 후에 형성되고 48시간 후에 안정적입니다. 그러나 이는 세포주마다 다를 수 있습니다. 필요한 경우 아가로스 캐스트가 있는 웰 플레이트를 조심스럽게 기울이고 P1000 피펫으로 주변 세포 배양 배지를 제거하여 세포 배양 배지를 변경합니다. 그런 다음 우물 벽을 따라 피펫으로 새 배지를 조심스럽게 추가합니다. 일반적으로 볼륨이 작고 스페로이드가 제거될 위험이 있기 때문에 캐스트 내의 매체를 변경할 필요가 없습니다.

2. T 세포와의 공동 배양

1. 적절한 T 세포 배양 배지(10% 소 태아 혈청 및 100 units/mL 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI)의 75 μL(35-마이크로웰 캐스트) 또는 190 μL(81-마이크로웰 캐스트)에 필요한 수의 T 세포를 재현탁합니다.
2. 먼저 웰 플레이트를 기울여 P1000 피펫으로 아가로스 캐스트를 둘러싼 세포 배양 배지를 제거합니다. 그런 다음 다른 손으로 웰 플레이트를 기울인 상태에서 P200 피펫으로 파종 챔버의 한쪽 모서리를 부드럽게 조준하여 캐스트 내의 매체를 천천히 조심스럽게 제거합니다.
3. (Critical step 1) 스페로이드를 제거할 위험이 있으므로 10배 배율로 현미경으로 관찰하여 배지를 제거하기 전과 후의 마이크로웰 내 스페로이드 수를 비교하여 스페로이드 손실을 제어합니다.
4. P200 피펫을 캐스트에서 약 0.5cm 위로 잡고 T-cell 현탁액을 아가로스 캐스트의 시딩 챔버에 조심스럽게 시딩합니다.
5. (중요 단계 2) T 세포를 추가하는 동안 스페로이드를 씻어낼 위험이 있습니다. 따라서 T 세포를 매우 천천히 파종 챔버에서 약 0.5cm 위에 추가하는 것이 중요합니다.
   메모: 플러시 아웃된 스페로이드의 수를 줄일 수 있는 한 가지 방법은 T 세포를 추가하는 동안 피펫을 시딩 챔버의 한쪽 모서리로 향하게 하여 이 모서리에 있는 스페로이드가 플러시 아웃될 위험만 있는 것입니다.
6. 웰 플레이트를 15분 동안 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 조심스럽게 다시 놓습니다.
7. 인큐베이터에서 웰 플레이트를 꺼내고 웰 벽을 따라 천천히 피펫팅하여 아가로스 캐스트 주위에 신선한 세포 배양 배지(10% 소 태아 혈청 및 100 units/mL 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Roswell Park Memorial Institute media(RPMI))를 추가합니다.
8. 웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 다시 48시간 동안 넣습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3D 페트리 접시	마이크로 티슈 Inc	Z764019 & Z764051	프로토콜에서 "고무 몰드"라고 합니다. 81-microwell 및 35-microwell 몰드
8-well 챔버 슬라이드	랩텍	154534
아가로스 I형, 낮은 EEO	시그마-알드리치	A6013
DMEM, 소 태아 혈청	써모피셔	11965092, 16000044	프로토콜에서 "세포 배양 배지"라고 합니다
RPMI	써모피셔	11875093	T세포 배양 배지용