면역 관련 유전자를 마우스 피부 조직으로 전달하는 Acufection-Mediated Delivery

초록

출처: Lin, Y., et al., "Acufection"에 의한 경제적인 DNA 전달 시스템 개발 및 피부 연구에 대한 응용. J. Vis. 특급 (2017)

이 영상은 마이크로니들을 이용한 침술을 통해 인터루킨-15 인코딩 플라스미드 DNA를 인터루킨-15 결핍 마우스 모델의 피부 조직으로 직접 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 미세침은 가장 바깥쪽 피부층에 미세천공을 생성하여 플라스미드 DNA가 피부 조직 내의 각질세포를 포함한 표피 세포로 흡수 및 형질주입되는 것을 용이하게 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 적응 절차

참고: DNA의 최적 양과 대상 피부 표면의 면적은 유전자에 따라 다를 수 있으며 추가 최적화가 필요합니다. 찌르는 힘과 피부의 각질층을 느슨하게 하는 횟수도 피부의 두께에 따라 달라질 수 있습니다. 이러한 조건은 qRT-PCR에 의해 침식된 유전자 전사체의 발현 수준을 평가한 후 신중하게 결정해야 합니다.

1. 마우스의 무게를 측정하고 복막 주사로 트리브로모에탄올(체중 gm당 400μg)을 투여합니다.
   참고: 2,2,2-트리브로모에탄올은 마우스에 일반적으로 사용된 주사용 마취제입니다. 용액은 2.5%의 2-메틸-2-부탄올을 함유한 비약제 등급 2,2,2-트리브로모에탄올(2.5g)을 증류수(200mL)에 용해시켜 만듭니다.
2. 마취 하의 건조를 방지하기 위해 수의사의 안과 연고를 눈에 사용하십시오.
   메모: 마취 효과는 1 - 2 분 안에 유도됩니다. 수술 전에 충분한 마취 깊이를 보장하기 위해 발가락 핀치 반사를 확인하십시오.
3. 등쪽 옆구리를 면도하고 제모 크림을 바르면 모간의 케라틴 단백질이 녹습니다.
   메모: 제모 크림을 사용하여 털을 제거하면 피부에 DNA를 쉽게 주입할 수 있습니다.
4. 물에 적신 면봉을 사용하여 제모 크림을 닦아냅니다.
   메모: 제모 크림은 물에 용해됩니다. 크림을 완전히 제거하면 표면이 기름지는 것을 방지하고 더 나은 찌르는 결과를 얻을 수 있습니다.
5. 70% 에탄올에 적신 멸균 면봉을 사용하여 피부 표면을 소독합니다.
6. 미리 측정된 스텐실로 제모된 피부의 대상 영역(1cm x 1cm)을 표시합니다. 메모: 대상 부위를 표시하면 정의된 영역 내에서 바늘 다발을 위아래로 적용하는 데 도움이 됩니다. 이는 실험 간 변동을 최소화하기 위해 특정 표면적에 동일한 양의 DNA를 전달하는 데 중요합니다.
7. 표시된 피부에 10μL 드롭의 플라스미드 DNA(10μg)를 놓습니다.
   메모: 침 치료를 위한 DNA의 양은 유전자와 발현 벡터의 유형에 따라 다릅니다. 관심 있는 실험을 수행하기 전에 사용되는 DNA의 양을 신중하게 적정해야 합니다. 10 μL는 작은 액체 방울이며 찌르는 동안 굴러 떨어지지 않고 면도 및 제모된 피부에 잘 맞습니다. 연구 유전자로 acufection된 마우스와 비교하기 위해 10μL의 빈 벡터 DNA로 처리된 마우스의 대조군을 포함합니다.
8. 침 다발(그림 1B)을 잡고 표시된 표면을 위아래로 100회 또는 피부의 PBS에 있는 DNA의 수분이 사라질 때까지 찌릅니다. 메모: 피부 표면이 약간 붉어질 수 있습니다. 번지는 깊은 절단을 피하십시오.
   피부 표면의 상하 찌르기 동작의 수는 PBS (10 μL)의 DNA에서 나온 수분이 피부에서 사라질 때 작동적으로 결정됩니다. 우리는 30초에 100번 결정했는데, 이는 침술 투여 유전자에서 가장 일관된 결과를 얻었기 때문입니다. 해당되는 경우 바늘은 최대 6개의 대상 피부 찌르기(각각 1cm x 1cm)에 재사용할 수 있습니다. 침술 사이에 70% 에탄올과 PBS로 바늘을 헹굽니다. 교차 오염을 피하기 위해 무뎌진 경우 새 바늘로 변경하거나 다른 플라스미드 DNA로 변경합니다.
9. 침술된 쥐를 발열 패드에 올려 깨어날 때까지 체온을 유지합니다.
10. 쥐가 충분한 의식을 되찾았을 때 우리로 되돌려 놓습니다. 메모: 침술을 받은 쥐는 굴절되지 않은 쥐의 우리와 별도의 우리(우리당 5마리 미만)에 보관합니다.
11. 물병을 제자리에 놓고 케이지를 IVC(Individual Ventilated Cage) 랙에 다시 넣습니다.

2. 수술 후 관리

1. 시술 후 처음 48시간 동안 마우스 마우스 행동 변화(안절부절, 초조함 또는 섭식 장애) 또는 비정상적인 외모(거친 털 또는 구부정한 자세)를 포함한 불편함이 있는지 면밀히 모니터링합니다.

결과

그림 1. 침술의 그림. (A) 침(36G x 0.5")은 손잡이와 바늘 끝으로 구성되어 있습니다. (B) 10개의 침을 접착 테이프를 사용하여 묶음으로 묶습니다. 번들의 길이는 눈금자(하단 패널)로 측정한 대로 약 4cm입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Accu 핸디 니들	아큐	36Gx0.5	의료기기
나이르TM 로션	교회 & 드와이트	해당 사항 없음	제모에 사용
Shandon Xyline 교체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	6764506	탈파라핀화
아베르틴(2,2,2-트리브로메탄올)	시그마-알드리치	T4,840-2	마취
2-메틸-2-부탄올	시그마-알드리치	152463	avertin의 용해를 위한 용매
QIAGEN® 플라스미드 미디 키트	키아젠	12143	E. coli에서 플라스미드 DNA의 정제
마우스 IL-15/IL-15R 콤플렉스 ELISA Ready-SET-Go 키트	이바이오사이언스	88-7215	IL-15 단백질 측정

선수 ) 년 년