종양 특이적 CAR T 세포의 항종양 활성을 평가하기 위한 In vitro 분석

초록

출처: Kueberuwa, G., et al. CD19 CAR T 세포의 전임상 평가를 위한 신유전자 마우스 B세포 림프종 모델. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 활성을 검증하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. CD19 항원을 발현하는 B세포 림프종 세포와 세포질 루시페라아제를 CD19 특이적 CAR T 세포와 공동 배양합니다. 종양의 CD19에 대한 CAR 결합은 CAR T 세포가 종양 세포 독성을 유발하는 사이토카인과 독소를 방출하도록 유도합니다. CAR T 세포 활성은 종양 세포에서 방출된 사이토카인과 감소된 루시페라제 매개 생물 발광을 정량화하여 평가합니다.

프로토콜

1. CAR T 세포 활성의 체외 검증

1. 96-well U-bottom 조직 배양 플레이트에서 100μL 완전 T 세포 배지(TCM)/웰 내 1 x 10⁴ 세포의 밀도로 루시페라아제 발현이 있거나 없는 신유전자 표적 CD19+ 종양 세포.
2. 100 μL/웰 부피에 1 x 10⁴ CD19 CAR T 세포/웰을 추가하여 1:1.
   의 이펙터 대 타겟(E:T) 비율을 달성합니다. 메모: 각 CAR 구조체 및 타겟 세포주에 대해 E:T 비율을 설정해야 합니다.
3. T 세포 단독 및 종양 세포 단독을 음성 대조군으로 사용하고 Phorbol-myristate-acetate (PMA) (50 ng/mL) 및 ionomycin (1 μg/mL)에 의해 자극된 T 세포를 인터페론-감마(IFNγ) 방출에 대한 양성 대조군으로 사용합니다. 37 °C에서 16-24 시간 동안 5 % CO₂에서 세포를 공동 배양합니다.
4. 공동 배양 후 500 x g에서 5분 동안 플레이트를 원심분리하고 추가 IFNγ 및 IL-12p70 ELISA 분석을 위해 상등액을 수집합니다.
   메모: 이것은 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
5. 루시페린이 함유된 PBS 100μL(최종 농도 1.5mg/mL)에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 플레이트를 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 적절한 광도계로 각 웰의 발광을 측정합니다.
   메모: 노출 시간은 세포주와 밀도에 맞게 최적화되어야 합니다. 대표적인 결과가 그림 1a에 나와 있습니다. CAR T 세포의 생체 외 세포독성은 표적 항원을 발현하는 세포주와 공동 배양을 통해 루시페린을 발현하도록 변형될 수 있습니다. CAR T 세포가 표적 세포를 죽이면 루시페린이 방출되므로 발광 신호의 감소는 세포 사멸과 상관관계가 있습니다. 형질도입되지 않은 세포는 특히 긴 배양 기간 동안 표적 세포의 생존율에 영향을 미칠 수 있습니다. 제조업체의 ELISA 프로토콜에 따라 상층액에서 쥐 IFNγ 및 IL-12p70의 농도를 측정합니다. 대표적인 결과는 (그림 1b 및 1c)에 나와 있습니다. 표적 항원을 발현하는 세포주와의 공동 배양에 의한 CAR T 세포의 생체 외 활성화는 ELISA를 사용하여 상층액 함량을 분석함으로써 측정할 수 있습니다. CAR T 세포와 표적 세포의 비율 및 공동 배양 기간은 각 CAR 구조체, 표적 세포주 및 분석물에 맞게 최적화되어야 합니다. PMA 및 이오노마이신 처리는 T 세포의 질과 반응 능력을 확인하기 위한 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다.

결과

그림 1. CAR T 세포 활성의 검증. αmCD19 CAR T 세포를 U-bottom 96-well plate에서 16시간 동안 루시퍼라아제(1 x 10⁴:1 x 10⁴)를 발현하도록 변형된 A20 림프종 세포와 공동 배양했습니다. 공동 배양 후, 세포를 펠렛화하고 상층액을 수집했습니다. A) 세포를 PBS에 다시 현탁시키고 발광계를 사용하여 표적 세포의 생존력을 평가했습니다. 공동 배양으로부터의 상등액은 IFNγ (B) 및 IL-12 (C)의 존재에 대해 평가되었다. CAR T 세포와 표적 세포의 비율과 공동 배양 기간은 각 CAR 구조체 및 표적 세포주에 맞게 최적화되어야 합니다. PM...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100X 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(PSG)	지브코	10378016
유세포분석기 - LSR Fortessa x20	BD 바이오사이언스	658222R1
소 태아 세럼	지브코	10270
IL-12 p70 마우스 코팅되지 않은 ELISA 키트	인비트로젠	88-7121-76
이오노마이신 칼슘 염	시그마- 알드리치	I0634 (영어
광도계 - Lumistart Omega	BMG 랩텍	제415-301
쥐 IFN-γ ELISA 키트	다이아클론	861.050.010
Phorbol 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA)	시그마- 알드리치	P8139
RPMI 1640 미디엄	론자	BE12-167F
제노라이트 D-루시페린	퍼킨 엘머	122799

년 ) 호 (영문)