암세포에 대한 자연살해세포독성 평가를 위한 체외 분석

초록

출처: Baik, C. H., et al. 쥐 태반 자연 살해 세포 세포 용해 기능 평가를 위한 플레이트 기반 세포 독성 분석. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 표적 암세포에 대한 자연살해(NK) 세포의 세포독성을 결정하기 위해 젖산 탈수소효소 방출 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 분석은 형성된 붉은 색 생성물의 흡광도를 측정하여 암세포에서 세포질 젖산 탈수소효소의 방출을 정량화합니다.

프로토콜

1. 세포 독성 분석 : 분석 프로토콜

1. 바닥이 둥글고 배양 처리된 96웰 플레이트를 사용하여 표 1에 제안된 대로 플레이트를 설정합니다. 이 표는 실험 대조군과 NK 실험 컬럼 3세트를 보여줍니다. 이는 96웰 플레이트에 총 10개의 NK 실험 컬럼으로 확장할 수 있습니다.
2. 250 x g에서 4분 동안 분석 플레이트를 원심분리하여 effector와 타겟 세포가 접촉하고 있는지 확인합니다. 96-well 플레이트를 37°C, 5% CO₂의 가습 챔버 인큐베이터에서 5시간 동안 배양하여 표적 세포와 효과기 세포 사이의 충분한 접촉을 달성하고 효과기 세포에 의한 표적 세포 용해를 달성합니다.
   메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
3. 상등액을 수확하기 45분 전에 10μL의 10x 용해 용액을 Target Cell Maximum LDH Release well(Wells 1E, 1F, 1G 및 1H)에 추가하고 플레이트를 가습 챔버에 다시 놓습니다.
4. 배양 시간이 완료된 후 250 x g에서 플레이트를 4분 동안 원심분리합니다. 멀티채널 피펫터를 사용하여 모든 웰의 50μL 분취액을 새로운 96웰 평면 바닥 분석 플레이트로 옮깁니다.
   메모: 세포가 새로운 분석 플레이트로 옮겨지지 않도록 웰의 바닥을 만지지 마십시오. 배양 처리된 플레이트를 새로운 분석 플레이트로 사용하지 마십시오.

2. 분석 시약을 만듭니다.

1. Assay Buffer가 실온에 도달한 후 12mL의 Assay Buffer를 하나의 Substrate Mix 병에 추가합니다. 완전히 녹을 때까지 뒤집고 부드럽게 흔듭니다. 2개의 96웰 플레이트에는 1병으로 충분합니다.
   메모: 분석 버퍼는 해동하는 동안 빛으로부터 보호되어야 합니다. 사용 직전에 혼합하십시오.
2. 4.6단계에서 분석 플레이트의 모든 well에 50μL의 분석 시약을 추가합니다. 접시를 호일로 덮어 빛으로부터 보호하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
   메모: 새로 만든 분석 시약은 냉동고에 보관해야 합니다. 시약은 약 8주 동안 유효합니다.
3. 각 웰에 50μL의 정지 용액을 추가합니다. Stop Solution을 첨가한 후 1시간 이내에 플레이트를 읽고 490nm.
   에서 흡광도를 기록합니다. 대표적인 데이터는 표 2에 나타내었다.

표 1: 분석 플레이트 레이아웃. TCS = 표적 세포 자발적 LDH 방출 (50 μL 표적 세포 + 50 μL 표적 세포 배지); TCM = 타겟 셀 최대 LDH 방출(50μL 타겟 세포 + 50μL 타겟 세포 배지); VCC = Volume Correction Control (50 μL 타겟 셀 배지 + 50 μL NK 셀 배지); CMB = 배양 배지 배경 대조 (50 μL 타겟 세포 배지 + 50 μL NK 세포 배지); ECSR = 효과기 세포 자연 방출(50μL NK 세포 + 50μL NK 세포 배지); EW = 실험용 웰(50μL 타겟 셀 + 50μL NK 셀).

개 개 개 개 표시기 표시기 시리즈 표시기 표시기 시리즈 표시기 표시기 시리즈 표시기 표시기 시리즈

1	2	3	4	5
증권 시세	증권 시세	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
증권 시세	증권 시세	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
증권 시세	증권 시세	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
증권 시세	증권 시세	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
티엠씨	CMB (CMB)	EW-1	EW-2	EW-3
티엠씨	CMB (CMB)	EW-1	EW-2	EW-3
티엠씨	CMB (CMB)	EW-1	EW-2	EW-3
티엠씨	CMB (CMB)	EW-1	EW-2	EW-3

표 2: YAC1 표적 세포에 대한 NP 및 RUPP 쥐의 태반 NK 세포의 세포 독성을 측정하기 위한 열 1 및 2열의 실험 대조군과 실험 웰을 포함하는 분석 플레이트의 원시 흡광도 데이터.

개 개 개 개 아오이트 호 호 호 명 명 명

1	2	3	4	5
		엔씨	루프	엔씨
0.615	0.484	0.473	0.463	0.471
0.586	0.484	0.458	0.474	0.469
0.61	0.486	0.464	0.459	0.469
0.605	0.55	0.524	0.526	0.543
0.576	0.504	0.519	0.502명 0.528	00.528
0.565	0.512	0.515	0.513	0.531
0.563	0.581	0.526	0.508	0.519

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 조직 배양 플레이트	셀트리트	229190	멸균, 둥근 바닥
셀 스크레이퍼	어부	8100241
Cytotox 96 비방사성 세포독성 분석 키트	프로메가	G1780 (영문
RPMI	지브코	11875135	1640 미디엄
YAC-1 세포	증권 시세	TIB-160

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