1. 폴리카프로락톤 트리아크릴레이트(PCLTA) 합성
- 400 Da 폴리카프로락톤(PCL) 트리올 3.2 mL를 열린 200 mL 둥근 바닥 플라스크와 탄산칼륨(K2CO3)을 90 °C의 유리 바이알에 넣고 50 °C에서 하룻밤 동안 건조시킵니다.
- 트리올을 6.4mL의 디클로로메탄(DCM) 및 4.246g의 K2CO3와 아르곤 아래에 혼합합니다.
- 27.2mL의 DCM에 2.72mL의 아크릴로일 클로라이드를 혼합하고 5분에 걸쳐 플라스크의 반응 혼합물에 적가합니다.
- 반응 혼합물을 알루미늄 호일로 덮고 아르곤 아래에서 24시간 동안 실온에서 방해받지 않고 그대로 두십시오.
- 24시간 후, 진공 상태에서 Buchner 깔때기의 여과지를 사용하여 반응 혼합물을 여과하여 과도한 시약을 폐기합니다.
- 디에틸 에테르에 엔드캡이 달린 고분자를 포함하는 1.5단계에서 1:3(vol/vol)로 여과액을 침전시키고 30°C에서 로타밥을 사용하여 디에틸 에테르를 제거합니다.
2. 폴리버블의 형성
참고: 탈이온수(DI)에 폴리머를 주입하면 폴리버블이 바이알 바닥으로 이동하여 바닥이 평평해집니다. 폴리버블 평탄화를 방지하기 위해 대신 10%(wt/vol) 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)를 사용하여 유리 바이알을 채웁니다.
- DI 물에 10%(wt/vol) CMC 용액을 준비합니다.
- 1mL 전사 피펫을 사용하여 0.92mL 유리 바이알에 0.8mL의 10% CMC를 채웁니다.
- DCM에서 14 kDa PCL 1000 mg/mL를 혼합하고 총 부피 200 μL에 대해 1:3(vol/vol)으로 PCLTA를 합성하거나 클로로포름에서 5 kDa 폴리(락틱-코-글리콜산) 디아크릴레이트(PLGADA) 1000 mg/mL 200 μL를 준비합니다.
- 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(광개시제)과 폴리머(PLGADA 또는 PCL/PCLTA) 혼합물을 0.005:1(vol/vol)로 혼합합니다.
- 내경이 0.016인치인 디스펜싱 스테인리스강 튜브에 연결된 주사기 펌프에 장착된 1mL 유리 주사기에 200μL의 폴리머 혼합물을 로드합니다.
- 마이크로 모터를 사용하여 폴리머 튜브의 전진 및 후진 동작을 제어하고 유리 바이알의 10% CMC에 폴리머를 주입하여 폴리버블을 형성합니다.
- 254 nm 파장에서 자외선 (UV)에서 2 W / cm에서 60 초 동안 폴리 버블을 경화2
.
- 액체 질소에서 폴리버블을 급속 동결하고 0.010mBar 진공 및 -85°C에서 밤새 동결 건조합니다.
- 겸자를 사용하여 건조된 CMC에서 폴리버블을 분리하고 DI 워터로 폴리버블을 세척하여 잔류 CMC를 제거합니다. 다른 폴리머는 방출 역학을 변경하기 위해 변형과 함께 사용될 수 있습니다.
3. polybubble 직경의 변조
- 1mL 전사 피펫을 사용하여 0.92mL 유리 바이알에 10% CMC를 채웁니다.
- PCL/PCLTA를 1000mg/mL 14kDa PCL과 1:3(vol/vol)로 혼합하고 PCLTA를 합성합니다. 광개시제를 0.005:1(vol/vol)의 고분자 혼합물과 혼합합니다.
- 내경이 0.016인치인 디스펜싱 스테인리스강 튜브에 연결된 주사기 펌프에 장착된 1mL 유리 주사기에 폴리머 혼합물을 로드합니다.
- 마이크로 모터를 사용하여 폴리머 튜브의 전진 및 후진 동작을 제어하고 유리 바이알의 10% CMC에 폴리머를 주입하여 폴리버블을 형성합니다.
- 다양한 직경의 폴리버블을 얻으려면 디스펜싱 속도를 0.0005에서 1μL/s까지 다양하게 설정합니다.
- 다양한 직경의 폴리버블이 있는 바이알의 이미지를 촬영합니다.
- ImageJ를 사용하여 폴리버블의 직경을 정량화하고 바이알의 크기를 스케일로 사용합니다.
4. 폴리버블 내 화물 센터링
- K2CO3 를 사용한 PCL / PCLTA 점도 조절 :
메모: 1000 mg/mL에서 5 kDa PLAGDA의 점도가 화물의 중심을 잡기에 충분하기 때문에 PLGADA의 점도는 K2CO3 를 사용하여 수정할 필요가 없습니다.
- 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL 및 60 mg/mL를 포함한 다양한 농도로 K2CO3 (PCLTA 반응 후 분리됨)를 PCLTA에 추가합니다.
- 유변 물성 측정을 사용하여 전단 속도를 0에서 1000 1/s로 변경하여 용액의 동적 점도를 측정합니다.
- K2CO3 농도가 다른 PCL / PCLTA 용액을 사용하여 형성된 polybubbles의 중간에화물을 수동으로 주입합니다 (4.1.1 단계). K2CO3 의 최적 농도를 결정하십시오 4.1.1 단계의 어떤 용액이 중간에화물을 보유 할 수 있는지 관찰하십시오.
- CMC를 가진 화물의 센터링(이미 작은 분자로 타당성이 보임)
- 화물의 점도를 높이기 위해 하룻밤 동안 회전기에서 5%(wt/vol) CMC와 화물을 혼합합니다.
- 폴리버블에 2μL의 화물 혼합물을 수동으로 주입하고 2W/cm2에서 60초 동안 254nm 파장의 UV 경화를 진행합니다.
- 액체 질소에서 폴리버블을 30초 동안 급속 동결하고 0.010mBar 진공 및 -85°C에서 밤새 동결 건조합니다.
- 겸자를 사용하여 건조된 CMC에서 폴리버블을 분리하고 DI 물로 세척하여 잔류 CMC를 제거합니다.
- 폴리버블을 반으로 자르고 컨포칼 현미경을 사용하여 반쪽을 이미지화하여 화물이 중앙에 있는지 확인합니다(사용된 여기 및 방출 파장은 6단계 참조).
5. 화물 배합
참고: 폴리버블 포뮬레이션은 소분자, 단백질 및 핵산을 포함한 다양한 화물 유형을 수용할 수 있습니다.
- 이전 연구에 따르면 단백질 화물의 경우 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 글리코 폴리머를 포함한 부형제를 사용하여 폴리버블 제형 중 단백질의 안정성을 향상시킵니다.
- 2단계의 프로토콜에 따라 polybubble을 형성합니다.
- HIV gp120/41 항원 625μL에 트레할로스 17.11g을 첨가하여 항원 용액을 준비합니다.
- polybubble 중간에 1μL의 항원 용액을 수동으로 주입합니다.
- 0일, 7일, 14일, 21일에 폴리버블을 열고 여기 파장과 방출 파장이 각각 497nm와 520nm인 항원의 형광을 기록합니다.
- 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 항원의 기능을 측정하고 5% 무지방 우유를 차단 완충액으로 사용합니다.
6. 화물의 방출
참고: 소분자 또는 항원을 화물형으로 사용할 수 있습니다.
- 소분자
- PLGADA 폴리버블의 경우 37°C, 50°C, PCL/PCLTA 폴리버블의 경우 37°C, 50°C, 70°C에서 400μL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 중심이 있는 아크리플라빈이 있는 폴리버블을 배양합니다.
메모: 체온 이상의 테스트를 권장하는 이유는 a) PCL 및 PLGA 내에서 금 나노막대(AuNR)를 레이저로 쏘는 동안 폴리버블이 도달하는 온도(50°C)를 시뮬레이션하기 위함입니다. b) PCL(50°C, 70°C)의 분해 과정을 가속화합니다.
- 각 시점에서 상층액을 수집하고 400μL의 새 PBS로 교체합니다.
- 플레이트 리더를 사용하여 수집된 상층액의 형광 강도를 정량화합니다.
메모: 아크리플라빈의 경우 416nm/514nm의 ex/em을 사용합니다.
- 항원
- PLGADA 폴리버블의 경우 37°C, 50°C, PCL/PCLTA 폴리버블의 경우 37°C, 50°C에서 400μL의 PBS에 중심을 둔 소 알부민 혈청(BSA)-488로 폴리버블을 배양합니다.
- 각 시점에서 상층액을 수집하고 400μL의 새 PBS로 교체합니다.
- 플레이트 리더를 사용하여 수집된 상층액의 형광 강도를 정량화합니다. BSA-488.
에 대해 497nm/520nm의 ex/em을 사용합니다.
메모: PCL/PCLTA 폴리버블에 대한 70°C에서의 방출 연구는 항원이 극한의 온도에 노출되는 것을 방지하기 위해 수행되어서는 안 됩니다.