락토바실러스 무세포 상등액의 항암 효과를 평가하기 위한 분석

초록

출처: Lee, J., et al. 결장직장암 세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 무세포 상등액을 사용하여 세포 사멸 평가. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 락토바실러스 무세포 상등액(LCFS)의 항암 효과를 연구하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. 결장직장암 스페로이드를 다양한 용량의 LCFS에 노출시키면 LCFS의 박테리아 대사 산물과의 상호 작용은 암세포의 세포사멸을 유도하여 스페로이드 구조를 파괴하고 용량 의존적 방식으로 세포 사멸을 초래합니다.

프로토콜

1. 박테리아 세포 배양 및 락토바실러스 무세포 상등액(LCFS)의 제조

참고: 1.2 – 1.9 단계는 혐기성 챔버에서 수행됩니다.

1. De Man–Rogosa–Sharpe(MRS) 한천 플레이트와 L-시스테인이 함유된 육수를 준비하고 고압증기멸균으로 살균합니다.
2. 20ppm 산소로 37°C로 유지되는 H₂ 혐기성 챔버에서 MRS 한천 플레이트를 사전 배양합니다.
3. 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 스톡을 해동하고 박테리아 배양액을 한천 플레이트에 접종합니다(그림 1A(i)).
4. 단일 박테리아 콜로니가 얻어질 때까지 37 °C 및 20 ppm 산소의 H₂ 혐기성 챔버에서 2 - 3 일 동안 박테리아를 배양합니다.
5. Hungate 유형 혐기성 배양 튜브를 세척하고 건조하십시오. 배양 튜브를 121°C에서 15분 동안 오토클레이브합니다.
6. 그런 다음 37°C 및 20ppm 산소의 H₂ 혐기성 챔버에서 튜브를 배양하여 산소를 제거합니다.
7. MRS 육수 2 - 3 mL를 튜브에 넣습니다. 부틸 고무 마개로 튜브를 밀봉하고 캡을 조입니다.
8. 루프가 있는 단일 콜로니를 얻어 500μL의 1x PBS가 있는 1.5mL 배양 튜브에 넣습니다. (그림 1A(ii)).
9. 1mL 주사기를 사용하여 콜로니를 현탁시킵니다(그림 1A(iii)). 튜브 뚜껑 중앙에 1mL 주사기의 바늘을 삽입하고 부유 콜로니를 흡인시킨 다음 MRS 배지에 다시 현탁시켜 이 작업을 수행합니다. (그림 1A (iv)).
10. MRS 육수 배지를 쉐이커 배양기에서 2일(37 °C, 5% CO₂, 200 rpm) 동안 배양합니다.
11. 분광 광도계를 사용하여 OD₆₂₀의 흡광도가 2.0에 도달할 때까지 박테리아 성장 곡선을 모니터링하여 광학 밀도(OD)를 측정합니다.
12. 1,000 x g에서 15분 동안 원심분리하여 박테리아 펠릿과 컨디셔닝된 배지를 분리합니다. 수집된 박테리아 펠릿을 1x PBS로 세척하고 10% 소 태아 혈청이 보충된 4mL의 RPMI 1640에 재현탁합니다. 배지에 항생제를 포함하지 마십시오.
13. RPMI에서 박테리아 펠릿을 유지하고 100rpm의 속도에서 5% CO₂로 37°C에서 4시간 동안 셰이커 인큐베이터에서 배양합니다.
14. 프로바이오틱스 상등액을 준비하려면 1000 x g에서 원심분리를 통해 박테리아 펠릿을 제거하고 4°C에서 15분 동안 제거합니다. 회수된 상등액을 0.22μm 필터를 사용하여 멸균 여과하고 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다.

2. 스페로이드의 생성

1. 대장암 세포주 준비
   1. DLD-1, HT-29 및 WiDr 세포주를 70-80% 포화도까지 단층으로 성장시키고 5% CO₂ 인큐베이터(성장 배지: 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI)에서 37°C에서 플레이트를 배양합니다.
   2. 100mm 페트리 접시에서 자란 세포의 경우 4mL의 1x PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다. 0.25% 트립신-EDTA 1mL를 추가하고 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 2분 동안 페트리 접시를 배양하여 세포를 해리합니다.
   3. 배양 후 현미경으로 세포 해리를 확인하고 5mL의 성장 배지로 트립신-EDTA를 중화합니다.
   4. 해리된 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 300 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
   5. 상등액을 버리고 3mL의 성장 배지로 부드럽게 재현탁합니다.
   6. 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 결정하기 위해 trypan blue로 세포를 계수합니다. (그림 1B(i))
2. 스페로이드 형성
   1. 15mL 원뿔형 튜브에서 2.1.5의 세포를 희석하여 1 - 2 x 10⁵ cells/mL를 얻습니다(그림 1B(ii)).
   2. 세포 현탁액에 0.6% 메틸셀룰로오스의 최종 농도를 추가하고 희석된 세포를 멸균 저장소로 옮깁니다.
      참고: 각 세포주에 대해 필요한 메틸셀룰로오스의 양을 적정하고 그에 따라 측정해야 합니다.
   3. 멀티채널 피펫을 사용하여 200μL의 세포를 초저 부착 96웰 원형 바닥 마이크로플레이트의 각 웰에 분주합니다. (그림 1B (iii))
   4. 37 ° C의 5 % CO₂ 인큐베이터에서 24-36 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
   5. 24 - 36 시간 후, 스페로이드 형성을 확인하기 위해 광학 현미경으로 플레이트를 관찰합니다.

3. LCFS로 3D 결장직장암 세포 치료

1. 2단계와 3단계에 설명된 대로 스페로이드를 생성합니다.
2. LCFS 처리를 수행하기 전에 동결된 LCFS를 실온(RT)에서 10 - 20분 동안 해동합니다.
3. LCFS 원액을 성장 배지에 접종합니다. 성장 배지에서 25%, 12.5% 및 6%로 연속 희석합니다(즉, 25% LCFS = 150μL 성장 배지 + 50μL LCFS).
4. 인큐베이터에서 스페로이드가 들어 있는 세포 배양 플레이트를 꺼내고 200μL 피펫을 사용하여 각 웰에서 성장 배지를 최대한 많이 제거합니다.
5. 세포에 LCFS가 있는 성장 배지를 추가하고 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 - 48 h.
   동안 배양합니다. 메모: 사용되는 부피는 다음과 같이 플레이트 크기에 따라 달라집니다: 6-well 세포 배양 플레이트의 경우 2 mL; 96웰 세포 배양 플레이트의 경우 200μL.

결과

그림 1: 스페로이드 형성 및 LCFS 준비의 개략도.

(A) LCFS 생성 프로토콜의 개략적 표현 이미지는 (i-iv)로 표시되며, (B) 메틸셀룰로오스 매개 스페로이드 형성의 개식도는 (i-iii)로 표시됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Applied Biosystems MicroAmp 광학 접착 필름	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	4311971	100 커버
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock 마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 투명, 비멸균, 500 튜브/팩, 10 팩/케이스	코 닝	SCT-200-C	500 튜브 / 팩, 10 팩 / 케이스
BD Difco Bacto 한천	BD (영어)	제214010	500 지
BD Difco 락토바실러스 MRS 육수	BD (영어)	재질 보기 DF0881-17-5	500 지
코닝 인산염 완충 식염수, 칼슘 및 마그네슘 미함유 1X, PH 7.4 ± 0.1	코 닝	21-040-이력서	500 밀리리터
Falcon 5 mL 원형 바닥 폴리스티렌 시험관, 셀 스트레이너 스냅 캡 포함	코 닝	352235	25/팩, 500/케이스
Fetal Bovine Serum, 인증, 미국 원산지	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	16000044	500 밀리리터
락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)	Korean Collection for Type Cultures (유형 문화에 대한 한국어 컬렉션)	KCTC 3112
L-시스테인 염산염 일수화물	시그마-알드리치	C6852-25G	25 지
메틸 셀룰로오스 (3500-5600mPa·s, 20°C에서 물에 2%)	티씨아이	M0185	500 지
MicroAmp Fast Optical 96-Well 반응 플레이트(바코드 포함), 0.1 mL	어플라이드 바이오시스템즈	4346906	20 접시
Millex-GS 주사기 필터 장치, 0.22 μm, 혼합 셀룰로오스 에스테르, 33 mm, 에틸렌 옥사이드 멸균	밀리포어	SLGS033SB	250
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15140122	100 밀리리터
RPMI-1640	지브코	11875-119	500 밀리리터
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	25200056	100 밀리리터
재료/장비/소프트웨어
CO2 인큐베이터	써모 피셔	헤라셀 150i
원뿔 튜브 15ml	증권 시세	50015
원뿔형 튜브 50ml	증권 시세	50050
Corning Costar 초저 어태치먼트 다중 웰 플레이트	시그마-알드리치	CLS7007
Corning Costar 초저 어태치먼트 다중 웰 플레이트	시그마-알드리치	CLS3471
Costar 50 mL 시약 저장용기, 5/백, 멸균	코스타	4870
Countess Cell Counting Chamber 슬라이드	써모피셔	C10228
Countess II FL 자동 세포 계수기	인비트로젠	AMQAF1000
EnSpire 멀티모드 리더	퍼킨 엘머		인스파이어 2300
Eppendorf Research Plus 멀티 채널 피펫, 8채널	에펜도르프	3122000051
인큐베이션 쉐이커	실험실 동료	시프-6000R
멀티 게이지 버전 3.0,	후지필름		도쿄, 일본
광학 밀도 (OD)LAMBDA UV/Vis 분광 광도계	퍼킨 엘머		월섬, 매사추세츠, 미국
위상차 현미경	올림푸스		도쿄, 일본
SPL 마이크로 원심분리기 튜브 1.5mL	증권 시세	60015
SPL 다중 채널 저장소, 12-chs, PS, 멸균	증권 시세	21012
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) 호 ) 명 ) 년 ) 표시기 년 표시기 년 년 표시기 년 표시기 년