인간 간 세포와 면역 세포를 이용한 인간화 마우스 모델 개발

초록

출처: Dagur, R. S. et al., HIV 관련 간 발병에 대한 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델의 확립.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오는 인간 면역 체계와 간 세포를 가진 이중 인간화 마우스 모델을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이는 인간 간 세포와 조혈 줄기 및 전구 세포를 비장 내 주사를 통해 형질전환 면역 결핍 마우스에 이식하여 간 세포의 생착과 인간 면역 세포의 발달을 유도하는 것을 포함합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 탯줄 혈액 처리 및 인간 조혈 줄기/전구 세포(HSPC)의 분리

1. laminar flow cabinets에서 멸균 상태에서 프로토콜의 모든 단계를 수행합니다.
2. 헤파린 튜브에 채취한 제대혈(CB)을 취하여 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하여 부피를 최대 35mL까지 만듭니다. 그림 1과 같이 림프구 분리 배지(LSM) 위에 샘플을 겹겹이 쌓고 400 x g에서 브레이크 없이 4°C에서 35분 동안 층상 CB로 LSM을 원심분리합니다.
   메모: 계면에서 섞이지 않도록 혈액을 조심스럽고 부드럽게 희석하십시오.
3. 상단 LSM과 플라즈마 층을 조심스럽게 제거하고 전사 피펫을 사용하여 흰색 버피 코트 인터페이스를 새 튜브로 옮깁니다.
4. 30 - 40 mL의 얼음처럼 차가운 완충액(PBS + 0.5% 소 혈청 알부민[BSA] + 2 mM 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA])에 버피 코트를 재현탁합니다. 피펫을 사용하여 20μL의 세포 현탁액과 20μL의 0.4% 트리판 블루 및 10μL의 혼합물을 계수 슬라이드의 두 챔버 중 하나의 외부 개구부에 피펫으로 결합하고 자동 세포 카운터에 슬라이드를 삽입하여 세포를 계수합니다.
   메모: 세포의 생존력을 유지하는 데 도움이 되므로 모든 단계에서 얼음처럼 차가운 완충액을 사용하십시오.
5. 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 그런 다음 300μL의 얼음처럼 차가운 완충액을 추가합니다.
6. 최대 1 x 10⁸ 세포에 대해 100μL의 human Fc receptor blocking 시약과 100μL의 monoclonal mouse anti-human CD34 anti-human CD34 antibody-conjugated microbeads를 추가합니다(재료 표 참조). 4°C에서 30분 동안 배양하고 10mL의 얼음처럼 차가운 완충액을 추가하여 세포를 세척한 다음 4°C에서 10분 동안 300 x g로 원심분리합니다.
   참고: 1 x 10⁸ 개 이상의 셀이있는 경우 셀 번호에 따라이를 확장하십시오.
7. 상등액을 조심스럽게 제거하고, 펠릿을 500μL의 완충액에 재현탁탁하고, 자기 분리 단계를 진행하여 HSPC를 농축합니다.
8. magnetic-activated cell sorting field에 positive selection LS column(재료 표 참조)을 배치하고 3mL의 buffer를 통과시킵니다.
9. 샘플에서 human CD34+에 결합된 마이크로비드를 포획할 수 있는 LS 컬럼에 샘플을 로드하고 중력의 영향을 받아 수집 튜브로 흐르도록 합니다.
10. 완충액으로 컬럼을 3x 세척하고 CD34^- 세포 분획의 동일한 수집 튜브에 용리액을 수집합니다.
11. 5mL의 완충액으로 컬럼을 밀어 CD34⁺ 세포를 새 수집 튜브로 용리시킵니다. >90%의 순도를 얻으려면 절차를 반복하십시오.
12. 혈구계에서 트리판 블루 염료를 사용하여 용리된 CD34⁺ 세포를 계수합니다. 계수 후 CD34⁺ 세포를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
13. 이식에 즉시 사용할 주사를 위해 CD34⁺ 세포를 25μL의 PBS에 재현탁시키거나 이식에 추가 사용하기 위해 동결 배지(Roswell Park Memorial Institute 배지[RPMI 1640 배지] + 50% 소 태아 혈청(FBS) + 10% 디메틸 설폭사이드[DMSO])에서 1-200만/mL의 농도로 세포를 동결 보존합니다.
    메모: 이식에 사용하기 전에 항상 생존 가능한 세포를 세십시오.
14. CD34⁺ 용리액의 순도를 확인하려면 현탁액 50μL를 취하여 4°C에서 30분 동안 10μL의 phycoerythrin 또는 PE 결합 항인간 CD34 항체와 함께 배양합니다. 항체 배양 후 염색된 세포를 PBS로 세척하고 PBS 100μL에 재현탁한 후 유세포분석을 진행한다. 항체가 없는 세포로 구성된 튜브를 추가하여 유세포분석기의 게이트를 설계합니다.
15. 획득 후 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 플롯에서 관심 영역을 선택한 다음 FSC 면적 및 FSC 높이 플롯에서 단일 셀에 대한 게이팅을 선택하여 데이터를 분석합니다. PE 채널 및 SSC 영역 플롯의 단일 세포에서 CD34 양성 세포를 게이트합니다.

2. 이식을 위한 인간 간세포(HEP)의 준비

1. 액체 질소에서 동결 보존된 간세포를 제거하고 바이알을 수조에 빠르게 담근 다음 약 90 - 120초 동안 해동합니다.
2. 바이알 캡을 제거하고 해동된 간세포를 예열된 해동 배지의 50mL 원추형 튜브에 붓습니다.
3. 50mL 튜브를 손으로 몇 초 동안 흔들어 세포를 현탁시킵니다.
   메모: 튜브를 와류로 돌리지 마십시오.
4. 실온에서 100 x g에서 8분 동안 셀을 펠렛화합니다. 0.1% BSA로 PBS에서 펠릿화된 세포를 세척하고 생쥐당 80μL의 최종 부피로 PBS에서 신선 또는 해동된 HSPC(비율 10:1)로 풀링합니다.

3. 인간 HSPC 및 간세포 이식을 위한 동물 취급, 스크리닝, 유전형 분석 및 치료

1. 동물 취급
   1. 심각한 면역 결핍의 결과로 무균 조건에서 TK-NOG 마우스를 사육, 수용 및 취급합니다.
   2. 잠재적인 병원성 미생물에 대한 감염을 방지하기 위해 항상 실험실 가운, 장갑, 신발 커버 및 안면 마스크를 착용하십시오.
   3. 수술을 위해 멸균 장갑과 기구를 사용하고 수술 내내 동물을 무균 상태로 다루십시오.
2. 실험을 위한 TK-NOG 마우스 선택
   1. 암컷 TK-NOG 마우스를 수컷 non-TK-NOG littercates와 교배하여 TK-NOG 균주 군체를 유지하고 유전자형 분석을 통해 형질전환 자손을 선택합니다.
      메모: 유전형 분석(genotyping)을 수행하여 이유식 전환 시 신생아 수컷 및 암컷 마우스에서 이식 유전자의 존재 여부를 확인합니다.
   2. HSV-TK 전이유전자 발현 간세포의 GCV 매개 고갈에 대한 민감도가 높기 때문에 생후 6-8주령에 이식을 위해 수컷을 선택합니다.
   3. 젖을 떼거나 수술할 때 생쥐를 쉽게 식별할 수 있도록 귀에 태그를 붙입니다. 동물의 체중과 건강 상태를 기록하십시오.
3. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응을 사용한 HSV-TK 전이유전자의 존재에 대한 유전형 분석
   1. 이유식 (보통 생후 3-4 주)에 유전형 분석을 수행합니다. 유전형 분석을 위해 laminar flow biological safety cabinet에서 마우스 귀 조각을 잘라 무균 상태를 유지하고 genomic DNA isolation kit를 사용하여 genomic DNA를 추출합니다.
   2. 20 μL 반응 혼합물에서 이어피스에서 추출한 게놈 DNA를 증폭하여 1 μL의 전방 프라이머 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL의 역방향 프라이머 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0.5 μL의 FAM 프로브 5'-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3'를 첨가하여 인간 알부민 프로모터의 제어 하에 HSV-TK 전이유전자를 스크리닝합니다. 및 실시간 중합효소연쇄반응(PCR) 기기에서 10μL의 마스터 믹스.
   3. Real-Time PCR 설정을 다음과 같이 설정합니다: 60°C에서 30초(사전 판독 단계), 95°C에서 10분(홀드 스테이지), 40°C에서 15초 동안 및 60°C에서 1주기(PCR 단계), 60°C에서 30초(판독 후 단계).
      메모: 22 미만의 역치(Ct) 주기는 HSV-TK 전이유전자에 대해 양성으로 간주됩니다.
4. ganciclovir 및 treosulfan을 사용한 치료
   1. 27G 바늘을 사용하여 TK-NOG 마우스에 7일째와 5일째에 100μL의 식염수를 넣어 하루 2회 복강내 GCV 주사(6mg/kg)를 주입하여 마우스의 형질전환 실질 세포를 고갈시킵니다(그림 2의 실험 전략 참조).
   2. 수술 3일, 2일, 1일째에 27G 바늘을 사용하여 100μL의 식염수에 비골수절제성 복강내 트레오설판(1.5g/kg/일)
   을 투여합니다.
   3. 수술 하루 전, 5mm 란셋으로 턱밑정맥에서 혈액을 2-3방울(~100μL) 떨어뜨린 후 알라닌 아미노전이효소(ALT) 분석을 위해 원심분리(4°C에서 10분 동안 1,500 x g)하여 혈청을 분리하여 간 손상 정도를 평가합니다.
5. 수술 준비
   1. 수술 전에 이발기를 사용하여 절개 부위(복막 벽 왼쪽)를 둘러싼 쥐의 털을 면도합니다.
   2. 마우스 마취기를 사용하여 유도 챔버에서 산소 유량을 1L/min으로 조정하고 이소플루란 유량을 3% - 5%로 조정합니다. 마취를 위해 한 번에 한 마리의 마우스를 유도실에 놓습니다.
   3. 멸균 확장 튜브(현탁액 보유 용량 550μL, 사양은 재료 표 참조)의 한쪽 끝을 30G 바늘에 부착하고 다른 쪽 끝을 1mL 주사기에 부착합니다.
   4. 주사기에 풀링된 HEP 및 HSPC(섹션 2 참조)의 현탁액(80μL/마우스)을 채우고, 반복적인 분주 피펫의 노치에 주사기를 끼우고, 각 프레스에서 10μL를 분주하도록 디스펜서를 조정합니다.
   5. 마우스가 마취되면(보통 3-4분 후) 이소플루란 흐름을 콧방울로 전환하고 이소플루란 유속을 2% - 3%로 줄입니다.
6. 마우스에서 인간 HSPC 및 간세포의 비장 내 이식
   1. 멸균 상태에서 층류 캐비닛에서 모든 수술 단계를 수행합니다.
   2. 작업 표면에 깨끗하고 멸균 드레이프를 깔고 절개하기 전에 10% 포비돈 요오드와 70% 이소프로필 알코올로 각 마우스의 몸 왼쪽을 문지릅니다.
   3. Vanna의 유형 가위로 복막 벽 왼쪽의 피부, 근육 및 복막을 작은 절개 (길이 ~ 1-1.5cm, 깊이 5mm)하여 흉곽 아래쪽 가장자리 약 5mm 아래의 복강으로 들어갑니다.
   4. 비장을 찾아 쉽게 접근할 수 있도록 집게로 수술 부위로 살짝 당긴 다음 30G 바늘을 비장의 아래쪽 극에 삽입합니다.
   5. 분주 피펫의 플런저를 잠금 해제하고 비장당 60-80 μL의 제한으로 한 번에 10 μL의 부피를 분주합니다. 바늘을 천천히 집어넣고 결찰 애플리어를 사용하여 결찰 클립으로 비장을 자릅니다.
   6. 멸균 PBS로 적신 솜 끝이 있는 어플리케이터로 비장을 체강 안으로 다시 밀어 넣습니다.
   7. 흡수성 봉합사 단속 봉합사 패턴(연속적이지 않음)을 사용하여 복벽의 근육층을 닫습니다. 비흡수성 봉합사를 사용하여 중단된 봉합사 패턴으로 피부를 닫으십시오.

결과

그림 1: 제대혈에서 CD34⁺ 세포의 농축 개략도.(A) 제대혈을 림프구 분리 배지(LSM)에 층을 이루고 원심분리하여 담황색 털을 분리합니다. (B) LS 컬럼을 마그네틱 스탠드에 놓고 BSA 버퍼로 헹군 다음 버피 코트를 추가합니다. CD34에 양성인 세포는 컬럼에 갇히고, CD34 세포는 별도의 튜브에 용리됩니다. 컬럼 수지에 갇힌 CD34⁺ 세포를 플런저로 플런저하고 새 튜브에 세포를 수집합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
27G1/2" 바늘	BD 생명과학	305109
30G1/2" 바늘	BD 생명과학	305106
5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브 12 x 75mm 스타일	코 닝	352054
BD 1 mL 투베르쿨린 주사기(바늘 없음	BD 생명과학	309659
BD FACS 어레이 바이오분석기	BD 바이오사이언스		용리된 CD34+ 세포의 순도 검사
BD FACS 어레이 소프트웨어	BD 바이오사이언스		FACS 어레이에서 획득한 CD34+ 세포를 분석하는 소프트웨어
BD FACS 용해 용액	BD 바이오사이언스	349202	적혈구를 용해시키기 위해
BD LSR II	BD 바이오사이언스		유세포 분석 시료 수집을 위한 기기
BD Vacutainer 플라스틱 혈액 수집 튜브	BD 생명과학	BD 367874	제대혈을 모으기 위해
소 세럼 알부민	시그마 알드리치	A9576
CD34 MicroBead Kit, 사람용	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-046-702	CD34+ HSPC의 분리용
CD34-PE, 인간	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-081-002	용리된 CD34+ 세포의 순도 검사에 사용되는 항체
세포 계수 슬라이드	바이오 라드	1450015
ChargeSwitch gDNA 미니 티슈 키트	써모피셔 사이언티픽	CS11204	이어피스에서 게놈 DNA 추출용
코튼 팁 애플리케이터	맥케슨	24-106-2초
DMSO(디메틸설폭사이드)	시그마 알드리치	D2650-5X5ML
확장 세트, Microbore Slide Clamp(s), Fixed Male Luer Lock. L: 60인치 L: 152cm PV: 0.55mL 유체 경로 멸균	BD 생명과학	30914	디스펜싱 피핏에 부착되고 HSPC 및 HEP suspesion으로 적재합니다.
FACS Diva 버전 6	BD 바이오사이언스		시료 수집에 필요한 유세포 분석기 소프트웨어
소 태아 세럼(FBS)	지브코	10438026
FLOWJO 분석 소프트웨어 v10.2	플로우조, LLC		유세포 분석 소프트웨어
간치클로비르	APP 제약, Inc.	315110	Prescripition 약물
Greiner MiniCollect EDTA 튜브	그라이너 바이오 원	450475
간세포 해동 배지	트라이앵글 리서치 랩(Triangle Research Labs)	MCHT50
Horizon Open Ligating 클립 애플리어	텔레플렉스	537061	결찰 클립을 잡으려면
인간 간세포	트라이앵글 리서치 랩(Triangle Research Labs)	허크1	동결 보존된 인간 간세포, 유도 자격
아이리스 가위, 스트레이트	테드 펠라, Inc.	13295
랜 싯	메디포인트	골든로드 5mm
LS 열	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-401	CD34+ 마이크로비즈를 포획하는 데 사용(positive selection)
림프구 분리 배지(LSM)	MP 바이오메디컬	50494	말초 혈액에서 림프구를 분리하기 위해
MACS 멀티스탠드	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-303	Qudro MACS 분리기 및 LS 컬럼 고정
McPherson-Vannas 마이크로 해부 스프링 가위	Roboz 수술 기구 Co.	RS-5605	비장을 노출시키기 위해 피부를 절개하는 데 사용됩니다.
마이크로 해부 겸자	Roboz 수술 기구 Co.	RS-5157	복막강에서 비장을 잡고 빼내기 위해
마우스 CD45-FITC	BD 바이오사이언스	553080	마우스별
PBS(인산염 완충 식염수)	하이클론	SH30256.02
Qudro MACS 분리기	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-090-976	4개의 LS 열을 보유합니다
RPMI 1640 배지	지브코	11875093
StepOne Plus 실시간 PCR	어플라이드 바이오시스템즈		유전자형을 분석하는 데 사용되는 기기
스테퍼 시리즈 반복 디스펜싱 피펫 1ml	다이맥스 코프	T15469	HSPC 및 HEP supension을 제어된 방식으로 분배하는 데 사용됩니다
TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스	써모피셔 사이언티픽	4369016
TC20 자동 셀 카운터	바이오 라드	1450102
TK-NOG 마우스			중앙 실험 동물 연구소 (CIEA, 일본, Drs. Mamoru Ito 및 Hiroshi Suemizu) 제공.
트레오설판	메닥 GmbH		제공: Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH)
트리판 블루	바이오 라드	1450022
Vannas형 마이크로 가위, 스트레이트, 80mm L	테드 펠라, Inc.	1346	비장을 노출시키기 위해 피부를 절개하는 데 사용됩니다.
Weck hemoclip 전통적인 티타늄 결찰 클립	봉합사	523700	주사 후 비장을 접합하기 위해

) 시리즈 년 . . 년