항원 특이적 CAR T 세포 생성 기술

초록

출처: Davidson, H. W., et al. 자가면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 1차 마우스 세포독성 T 세포의 고효율 생성. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 레트로바이러스 형질도입을 통해 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 기술을 보여줍니다. 활성화된 쥐 CD8+ T 세포를 재조합 피브로넥틴 단편으로 코팅된 마이크로웰 플레이트에 첨가합니다. 그런 다음 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 형질전환 RNA를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 도입하고 플레이트를 원심분리하여 형질도입을 용이하게 합니다. 배양 후, 형질도입된 세포는 표면에 항원 특이적 CAR을 발현합니다.

프로토콜

1. 단쇄 Fab 항체(scFab)-CAR의 생성 및 검증.

참고: CAR은 일반적으로 항원 표적 도메인, 스페이서/막관통 도메인, 세포질 신호 도메인의 3가지 핵심 도메인을 포함합니다. 각 CAR의 정확한 설계는 의도된 표적에 따라 다르므로, 레트로바이러스의 생성과 관련된 구조체의 주요 특징을 제외하고는 이 프로토콜에서 자세히 설명하지 않을 것입니다. 아래 설명된 연구에 사용된 CAR의 전체 설계는 그림 1에 나와 있습니다. 요컨대, 표적 도메인은 반강성 링커(semi-rigid linker)에 의해 연결된 모 단클론 항체로부터 중쇄의 전체 경쇄 및 변수 및 CH1 도메인으로 구성됩니다. spacer/transmembrane domain은 mouse CD28에서 유래한 것이고, 신호 전달 domain은 mouse CD28, CD137 (4-1BB) 및 CD247 (CD3ζ)의 element를 포함하는 fusion입니다. 이러한 요소는 스플라이스 오버랩, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 적절한 "유전자 블록"의 합성과 같은 표준 분자 생물학 절차에 의해 조립됩니다. mAB287 CAR의 세대에 대한 자세한 내용은 Zhang et al.에 포함되어 있습니다. cDNA 염기서열은 요청 시 저자로부터 얻을 수 있습니다.

1. CAR 구문 어셈블
   1. 표적 단쇄 Fab 항체(scFab) 및 결합된 스페이서/신호 도메인을 개별적으로 합성하고 "3점" 결찰 기술을 사용하여 최종 구조를 조립합니다(그림 1).
      참고: CAR 삽입체에 대한 주요 요구 사항은 레트로바이러스 발현 벡터 pMSCV-IRES-GFP II(pMIG II)로의 결찰을 허용하는 플랭크 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함해야 한다는 것입니다.
2. CAR 표면 발현 검증
   1. 표준 프로토콜(예: Holst 등)에 의해 생성된 pMIG II 유래 레트로바이러스 입자를 사용하여 하이브리도마 세포를 형질도입합니다.
   2. 유세포 분석을 실행하여 CAR 벡터에서 GFP의 발현을 검출합니다.
   3. 마우스 κ 사슬에 대해 표지된 항체를 사용하여 형질도입된 하이브리도마의 CAR의 염색 표면 발현(예: 클론 RMK-45).
3. CAR 특이성 검증
   1. 형질도입된 하이브리도마 세포를 적절한 플레이트 결합 또는 세포 항원으로 자극합니다. 하룻밤 동안 공동 배양 후 상층액과 분비된 사이토카인을 수집하고 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)으로 분석합니다.
      참고: 이상적으로는 각 CAR이 transduction에 사용되기 전에 독립적으로 검증되어야 합니다. 이 단계에서 실험을 일시 중지하고 나중에 다시 시작할 수 있습니다.

2. 바이러스 생산자 세포의 형질 주입(day - 4 - day 3)

참고: 레트로바이러스는 Phoenix-ECO 세포를 사용하여 생산됩니다(재료 표 참조). 감염 가능성이 있는 병원체의 생성에 대한 적절한 예방 조치를 취하십시오(형질주입/형질도입된 세포를 배양하기 위해 지정된 Biosafety level 2(BSL-2) 캐비닛 및 별도의 인큐베이터를 포함하는 것이 바람직함).

1. 피닉스 세포 해동 (-4일차)
   1. 2 x 10⁶ Phoenix-Eco 셀을 해동합니다. 여러 번의 형질도입이 계획된 경우 Phoenix 세포의 수를 확장하십시오.
   2. 10cm 조직 배양 접시에 10mL의 배지(10% 태아 송아지 혈청(FCS)를 함유한 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM))와 함께 플레이트에 넣습니다.
2. 통로 피닉스 세포(-3일차)
   1. 배지를 제거하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL로 세척합니다.
   2. 0.25% 트립신 3mL를 첨가하고 37°C에서 10% CO₂ 기압에서 3분 동안 배양합니다.
   3. 세포를 수확한 다음 200 x g에서 3분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 10mL의 새로운 배지로 세포를 재플레이팅하고 37°C에서 배양합니다.
3. Phoenix 세포 조사 (Day -1 오후)
   1. 추가 세포 분열을 최소화하려면 2.2단계에서 설명한 대로 Phoenix 세포를 수집하고, 5mL의 배지에 재현탁하고, 얼음(1000 rad)에서 세포를 감마선으로 조사합니다.
      알림: 방사선 작업에는 인명 노출을 피하기 위해 주의를 기울여야 합니다.
   2. 방사선 조사된 세포를 원심분리하고, 새로운 배지에 재현탁하고, 2 x 10⁶ 세포(10mL 배지)/플레이트/CAR에 플레이트를 삽입하고 배양합니다.
4. Transfection (0일차 - 아침)
   1. Phoenix 세포에서 상등액을 흡인하고, 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고, 단층이 방해받지 않도록 7mL의 환원된 혈청 배지(예: Opti-MEM)를 플레이트의 측벽에 조심스럽게 적가합니다. 세포를 다시 인큐베이터로 옮깁니다.
   2. 14mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 튜브 2개를 각각 1.5mL의 환원 혈청 배지를 추가합니다. 하나의 튜브에 40μL의 transfection 시약을 추가합니다(재료 표 참조).
   3. 다른 튜브에 Ab-CAR-plasmid 15μg(단계 1에서 생성)과 envelope 및 packaging plasmid 5μg(5μg pCL-Eco)을 추가합니다. 실온에서 튜브를 5분 동안 배양합니다.
   4. 2.4.2 단계의 transfection 시약 혼합물을 튜브 측면과 접촉하지 않고 두 번째 튜브에 적가하여 첨가하고 용액을 위아래로 부드럽게 3회 피펫팅하여 혼합합니다. 실온에서 최소 20분 동안 배양합니다.
   5. 혼합물 3mL를 Phoenix 세포에 적가하여 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.
   6. 4-5시간 후에 FCS 1mL를 추가합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.
5. 중간 변동 (1일차)
   1. 플라스미드/형질주입 시약 복합체를 포함하는 상층액을 제거하고 감염 물질 취급을 위한 제도적 절차에 따라 폐기합니다. 신선하고 예열된 배양 배지 4mL를 세포에 추가합니다.
6. 형질도입을 위한 바이러스 수확(2일차)
   1. 멸균 주사기, 필터(0.45μm)로 Phoenix 세포에서 바이러스 함유 배지를 수집하여 잔류 세포 파편을 제거하고 새 튜브에 수집합니다.
   2. 재조합 인간 인터루킨-2(rhIL-2) 스톡을 최종 농도 200 IU/mL에 추가합니다. 형질도입을 위해 바이러스를 즉시 사용합니다(5.3단계). Phoenix 세포에 새로운 배지 4mL를 추가하고 인큐베이터에 넣습니다.
7. 바이러스 수집 반복(3일차)
   1. 2.6단계를 반복하되 새로운 배지를 추가하는 대신 Phoenix 세포를 감염성 폐기물로 폐기합니다. 이 상등액은 5.4단계에서 사용됩니다.

3. 1차 CD8 T 세포 분리 및 활성화(-1일에서 0일)

참고: 이전에는 암컷 비만 당뇨병(NOD) 마우스에서 섬 염증이 시작되기 전인 4-5주에 CD8 T 세포를 수집했습니다. IACUC(Institutional Animal Care & Use Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 모든 마우스를 처리합니다. CD8 T 세포는 상용 음성 선택 키트를 사용하여 비장 세포에서 농축됩니다.

1. CD3/CD28 항체로 플레이트를 코팅(-1일차)
   1. 24웰 플레이트의 각 웰에 항마우스 CD3 및 CD28 항체(둘 다 PBS에서 1μg/mL) 혼합물 1mL를 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
   2. 다음날, 쥐 CD8 T 세포를 추가하기 전에 1mL의 멸균 PBS로 플레이트를 3회 세척합니다(4.1단계).
      참고: 코팅할 웰의 수는 필요한 활성화된 CD8 T 세포의 총 수에 따라 각 실험마다 다릅니다.
2. 비장세포 채취(Day 0)
   1. 4-5주 된 NOD 암컷 마우스 2마리를 CO₂ 흡입 후 참수를 사용하여 안락사시킵니다. 비장을 채취하여 얼음 위의 세포 배양 접시에 10mL PBS를 담근 세포 여과기에 넣습니다.
   2. 세포 배양 후드에서 각 비장을 3-5개 조각으로 자르고 3 또는 5mL 주사기의 멸균 플런저로 조직을 눌러 비장 조각을 강제로 분리하고 세포가 철망을 통과할 수 있도록 합니다.
   3. 1:4 희석된 적혈구 용해 완충액(비장 1개당 PBS 3mL에 용해 완충액 1mL)에 비장 세포를 재현탁하고 실온에서 5분 동안 배양하여 적혈구를 부드럽게 제거합니다.
   4. 그런 다음 혈구계로 세포 계수를 위한 트리판 블루 염료 용액으로 세포 현탁액 10μL를 희석하고 나머지 세포를 350 x g에서 7분 동안 원심분리하여 펠렛
   화합니다.
3. CD8 T 세포 농축(Day 0)
   1. 제조업체의 지침에 따라 마우스 CD8 T 세포 분리 키트를 사용하여 음성 선택으로 CD8 T 세포를 농축합니다.
      참고: 고순도를 보장하려면 추가할 비오틴화 항체의 부피를 계산할 때 항상 세포 수를 반올림합니다(예: 계산된 9.1 x 10⁷ 세포에 대해 10⁸ 세포에 대해 제안된 시약 부피 사용).
   2. 1 x 10⁸ 세포당 400μL의 완충액과 100μL의 비오틴-항체 칵테일에 세포 펠릿을 현탁하고 잘 섞은 후 항체 결합을 위해 냉장고(4°C)에서 5분 동안 배양합니다.
   3. 1 x 10⁸ 세포당 300 μL의 라벨링 버퍼와 200 μL의 항비오틴 마이크로 비드를 첨가하고 잘 혼합한 후 4 °C에서 10분 동안 배양합니다.
   4. 마이크로 비드 결합을 기다리는 동안 분리기에 분리 컬럼을 설정합니다. 3mL의 라벨링 버퍼로 헹궈 컬럼을 세척합니다.
   5. 1000μL의 비드/셀 혼합물을 40μm 셀 스트레이너에 통과시킨 후 분리 컬럼에 로드하여 세포 응집체를 제거합니다. 컬럼 플로우스루(flow-through)를 예냉각된 15mL 튜브에 수집합니다.
   6. 제조업체의 지시에 따라 컬럼을 세척하여 모든 폐수를 동일한 튜브에 모으십시오. 세포 수를 측정하고(3.2.4단계와 동일) 350 x g에서 5분 동안 원심분리하여 수집합니다. 완전한 T 세포 배지 2mL(FCS, 2-메르캅토에탄올, rhIL-2(200 U/mL), 마우스 인터루킨-7(mIL-7, 0.5ng/mL), ITS, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 및 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 RPMI-1640)에 재현탁하고 350 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다.
   7. 예열된(37°C) 완전 T 세포 배지에 0.25–0.5 x 10⁶/mL의 농도로 세포를 재현탁합니다.

4. T 세포 활성화 (0-2 일)

1. 3.1.2단계에서 CD3/CD28 항체가 코팅된 24웰 플레이트의 각 코팅된 웰에 2mL의 세포 현탁액(0.25–0.5 x 10⁶/mL)을 추가합니다. 소용돌이치는 동작을 사용하여 셀을 고르게 분배합니다.
   참고: 소용돌이 모션을 사용하여 셀을 추가하여 고르게 분포시키고 가장자리 효과를 최소화합니다. 세포가 웰의 가장자리를 따라 모여 있으면 형질도입 속도와 세포 생존율이 모두 감소합니다.
2. 대조군으로, 동일한 수의 CD8 T 세포를 플레이트의 코팅되지 않은 단일 웰에 플레이트합니다. 48 h.
   동안 10% CO₂ 가스 주입기를 사용하여 37°C에서 세포를 배양합니다. 참고: 48시간 후에는 현미경을 사용하여 활성화를 확인할 수 있습니다. 활성화된 세포는 항-CD3/CD28 항체를 만나지 않은 세포보다 클 것입니다.

5. 활성화된 CD8 T 세포의 형질도입(1-3일)

참고: 이 프로토콜은 스핀 변환 방법을 사용합니다. 내부 온도를 37°C로 유지할 수 있는 스윙 아웃 로터와 조직 배양 플레이트 어댑터가 있는 원심분리기가 필요합니다. 최대 효율성을 보장하기 위해 형질도입 당일에 바이러스를 포집하기 전에 원심분리기를 37°C로 예열합니다.

1. 인간 피브로넥틴 단편 코팅 플레이트의 제조(Day 1 - Day 2)
   1. 1일차에 24웰 플레이트의 웰에 0.5mL의 피브로넥틴(PBS의 경우 50μg/mL)을 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
      참고: 일반적으로 형질주입된 Phoenix 세포의 플레이트당 2개의 피브로넥틴 코팅된 웰이 필요합니다.
   2. 2일차에 피브로넥틴 용액을 제거하고 PBS에 2% 소 혈청 알부민(BSA) 1mL로 교체합니다. 실온에서 30분 동안 배양하여 비특이적 결합 부위를 "차단"합니다.
   3. 처리된 웰을 1mL의 멸균 PBS로 세척합니다. 세척 용액을 제거한 후 플레이트를 사용할 준비가 되었습니다. 또는 밀봉하여 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 활성 CD8 T 세포 채취(2일차)
   1. 활성화된 CD8 T 세포를 수확하고, 트리판 블루 또는 적절한 자동화 기기를 사용하여 세포 생존율을 계수 및 계산합니다.
   2. 원심분리로 세포를 수집하고 형질도입을 위해 5 x 10⁶ viable cells/mL로 재현탁합니다. CO₂ 인큐베이터의 완전한 T 세포 배지에서 배양 중인 세포의 작은 분취량을 유지하여 형질도입된 세포의 후속 형광 활성화 세포 분류에 대한 제어를 제공합니다(6단계).
      참고: 48시간 동안 활성화한 후 총 세포 수는 약 1.5배 증가해야 하며 생존율이 95% 이상이어야 합니다.
3. Transduction (2일차)
   1. 웰당 100μL의 활성 CD8 세포 현탁액(0.5 x 10⁶ 세포)을 피브로넥틴 코팅 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 1.5–2mL의 바이러스 함유 배지(2.6단계)를 각 웰에 추가합니다. 소용돌이치는 동작을 사용하여 혼합하여 세포를 고르게 분배합니다(그림 2).
   2. 플레이트를 지퍼 잠금 비닐 봉지에 넣고 밀봉합니다(2차 격리를 제공하기 위해). 2000 x g에서 37°C에서 90분 동안 원심분리기.
   3. 원심분리기에서 플레이트를 제거합니다. 생물학적 안전에서 캐비닛은 비닐 봉지를 조심스럽게 제거하고 플레이트 외부가 매체로 오염되지 않았는지 확인하십시오.
   4. 그런 다음 플레이트를 전용 37°C CO₂ 인큐베이터로 옮깁니다. 4시간 후, 각 웰에서 배지 1mL를 제거하고 예열된 완전한 T 세포 배지 1mL로 교체합니다. CO₂ 인큐베이터의 플레이트를 교체합니다.
      참고: 형질도입된 세포의 모든 배지를 감염성 폐기물로 처리합니다.

결과

그림 1: CAR 레트로바이러스 구조체의 개략도. CAR은 적합한 마우스 단클론 항체의 Fab 단편에서 유래한 표적 도메인과 마우스 CD28, CD137 및 CD247의 스페이서/멤브레인 앵커/신호 도메인으로 구성됩니다. 합성 cDNA는 pMIG-II 레트로바이러스 발현 벡터에 삽입됩니다. mAb287-CAR을 생성하는 데 사용되는 제한 엔도뉴클레아제 부위가 표시됩니다.

그림 2: 세포 분포에 대한 다양한 도금 방법의 효과. (왼쪽) 소용돌이 운동을 사용하여 피...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-메르캅토에탄올 (50mM)	지브코	21985-023	50 음
5' 레이스 PCR	클론텍	634859
anti-mouse CD28 항체와 관련상품	이바이오사이언스	Tel.: 14-0281-86	1μg/ml에서 최종 농도
안티-마우스 CD3e 항체	이바이오사이언스	145-2C11	1μg/ml에서 최종 농도
비오틴 쥐 안티 마우스 IFN-γ	BD 바이오사이언스	554410	0.5 μg/ml에 있는 작업 농도
증권 시세	시그마	A7030
Endo-free Maxi-Prep 키트	키아겐	12362
겐타마이신	지브코	제15750-060	최종 50μg/ml.
열 비활성화 FCS	하이클론	SH30087.03	최종 10% FCS
헤페스 (100X)	지브코	제15630-080	1배
인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민(ITS 100x)	써모피셔	51500056	최종 농도는 1x입니다.
리포펙타민 2000	인비트로젠	11668019
LS 컬럼	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-401
MACS 분리 버퍼	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-091-221
마우스 CD8a+ T 세포 분리 키트	밀레테니 바이오텍 Inc	Tel.: 130-104-075
마우스 CD8a+ T 세포 분리 키트	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-104-075
Opti-MEM 배지	써모피셔	31985070
페니실린-스트렙토마이신(5000U/ml)	써모피셔	15070063	50 U/ml
Phoenix-ECO 세포	증권 시세	CRL-3214
인산염 완충 식염수(PBS)	지브코	제10010-023
pMIG II	애드진	52107
PMSCV-IRES-GFP II	애드진	52107
적혈구 용해 완충액	시그마	R7767
레트로넥틴	다카라	T100ᅡ	PBS에서 50 μg/ml의 작업 농도
rhIL-2 (재고 농도 105 IU / ul)	페프로텍	200-02	200 IU/ml에서의 최종 농도
rmIL-7 (재고 농도 50ng / ul)	R&D	407-ML-005	0.5ng/ml의 최종 농도
RPMI-1640	지브코	11875-093
멸균 세포 스트레이너	피셔 사이언티픽	Tel.: 22-363-548
트리플	지브코	제12605-028

년 표시기 년 호 호 표시기 (영문) 호 년 년 호