제브라피시 배아에서 녹농균 감염에 대한 파지 요법

초록

출처: Cafora, M., et al., A. 낭포성 섬유증 제브라피시 배아에서 녹농균 감염에 대응하기 위한 파지 요법 적용. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오는 낭포성 섬유증 제브라피시 배아에서 녹농균 감염을 표적으로 하는 파지 요법 기술을 보여줍니다. 파지 요법은 박테리아에 감염된 CF 제브라피시 배아에서 박테리아 부하를 효과적으로 줄이고 전염증성 면역 반응을 완화하여 CF 배아 치사율을 감소시킵니다.

프로토콜

1. 제브라피시 배아에 박테리아와 파지 칵테일을 미세주입

참고: 전신 감염을 수행하려면 배아가 일반적으로 26hpf 이후에 시작되는 혈액 순환이 있어야 합니다.

1. 26 hpf 후, 프로나제 분말을 2 mg/mL의 농도로 E3 배지에 용해시켜 제조된 프로나제 용액으로 배아를 디코리온산합니다. 융모막을 끊기 위해 배아를 부드럽게 피펫으로 분사합니다. 프로나제/E3 배지를 버리고 새 E3로 접시를 여러 번 헹구어 모든 프로나제를 제거합니다.
2. 주사 약 5분 전에 트리카인을 함유한 E3 배지에서 제브라피쉬 배아를 마취합니다.
3. 마취된 배아를 1단계에서 준비된 트랙에 피펫팅합니다. 미세한 젤 로딩 팁을 사용하여 배아를 측면 위치에 정렬합니다.
4. 미세주사 바늘에 약 5μL의 녹농균 제제를 로드합니다.
5. 바늘을 노른자 주머니 위로 퍼지기 시작하는 Cuvier 덕트의 시작점에 등쪽으로 삽입합니다. 1-3 nL의 부피를 주입하고 부피가 덕트 내에서 직접 팽창하여 순환으로 들어가도록 합니다.
배
6. 아를 50회 주입할 때마다 100μL의 멸균 PBS가 있는 1.5mL 원심분리 튜브에 박테리아 한 방울을 주입하여 주입량이 동일하게 유지되는지 확인합니다. CFU를 평가하기 위해 하룻밤 동안 37°C에서 LB 한천(표 1 참조)에 접종물을 플레이트로 부착합니다.
7. 미세주입된 배아를 신선한 E3 배지 + PTU(표 1)가 있는 두 개의 깨끗한 페트리 접시에 옮기고 28°C에서 배양합니다.
8. 박테리아 주입 후 30분 또는 3시간의 두 가지 선택된 시점에서, 인큐베이터에서 박테리아 주입 배아가 있는 페트리 접시 중 하나를 꺼내 파지 칵테일 주입에 대한 6.3에 설명된 대로 트랙에 정렬합니다.
9. 약 5μL의 파지 칵테일(균주 PAO1을 감염시키는 4개의 파지 혼합물)이 포함된 마이크로주입 바늘에 미세한 겔 로딩 팁을 로드하고 마이크로인젝터에 고정합니다.
10. 이전에 박테리아가 주입된 배아의 큐비에 관에 파지 칵테일을 주입합니다.
11. 미세주입된 배아를 신선한 E3 배지 + PTU가 있는 두 개의 깨끗한 페트리 접시에 옮기고 28°C에서 배양합니다.

표 1: 솔루션 준비

솔루션	준비
마취 원액 25X	증류된 H2O에 있는 트리카인 4 mg/mL.
마취 작업 솔루션 1X	증류된 H2O에 트리카인 스톡 용액 25X 준비물을 희석하여 증류된 H2O의 1X 농도(0.16mg/mL) 트리카인에 도달합니다.
CsCl d=1.3	50mL TN에서 20.49g
CsCl d=1.4	50mL TN에서 20.28g
csCl d=1.5	34.13g(50mL TN)
CsCl d=1.6	TN 50mL 중 41.2g
제브라피쉬 배아를 위한 E3 배아 배지	1 L 1of E3 (증류 된 H2O로 50X 스톡을 희석) + 200 μl의 0.05 % 메틸 블루. RT에 보관하십시오.
E3 배아 배지 원액(50X)	증류된 H2O 5L에 NaCl 73.0g, KCl 3.15g, CaCl2 9.15g 및 9.95g MgSO4. RT에 보관하십시오.
LB 한천	10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L NaCl, 10 g/L 한천
LB 육수	1L: H2O 950mL, 트립톤 10g, NaCl 10g, 효모 추출물 5g
PBST (영문)	PBS 1배 + 트리톤 X 1%
생리학적 해결책	0.9% 염화나트륨
색소 침착 차단 스톡 솔루션 10X	제브라피쉬 배아용 E3 배아 배지의 0.3mg/mL 페닐 티오우레아(PTU) 분말
프로나제 원액 5X	제브라피시 배아용 E3 배아 배지의 5mg/mL 프로나제 분말
TN 완충액	10mM 트리스 HCl pH 8.0, 150mM NaCl

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
박토 한천	BD (영어)	제214010
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 PBS	시그마-알드리치	D8537
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이	시그마-알드리치	886-86-2	통칭 트리카인
Femtojet 마이크로 매니퓰레이터	에펜도르프	5247
미세주삿바늘	하버드 기구
N-페닐티오우레아 >=98%	알드리치-P7629	103-85-5
프로나제	시그마-알드리치	9036-06-0
Z-MOLDS 미세사출	Word 정밀 기기

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