쥐의 절편화된 아킬레스건에 혈소판이 풍부한 혈장 주입

초록

출처: Greimers, L., et al. 쥐의 절편화된 아킬레스 건이 치유 과정에 미치는 동종 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 효과: 방법론적 설명. J. Vis. 특급. (2018).

이 비디오는 쥐의 절편된 아킬레스건에 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)을 주입하는 기술을 보여줍니다. 수혜자 쥐의 아킬레스건에서 작은 부분을 절제하고, 해당 부위를 봉합하고, 쥐가 회복할 수 있도록 합니다. 동시에, 기증자 쥐에서 전혈을 채취하고 원심분리하여 PRP를 얻은 다음 활성화하고 수혜자 쥐의 봉합 부위에 주입하여 힘줄 복구를 유도합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물 준비

1. 무게가 320-450g인 2개월 된 수컷 Sprague-Dawley 쥐 132마리를 사용합니다(실험용 쥐 120마리, 혈액 채취용 쥐 12마리, 그림 1). 각 그룹에 15마리의 쥐를 두면 0.8의 거듭제곱(지정된 효과가 존재하는 경우 통계적 유의성을 찾을 확률 80%)에 충분했습니다.
2. 모든 쥐를 탈의실이 갖춰진 재래식 시설의 격리 상태에서 고전적인 우리에 수용합니다. SPF(특정 병원균이 없는) 쥐를 특별히 구매하여 IVC(Individual Ventilated Cage) 랙에서 번식을 시작합니다.
3. 다음 하우징 조건을 사용하십시오 : 온도 범위는 19-24 ° C; 상대 습도 : 40-60 %; 환기 : 공기 재생 빈도 : 시간당 10-15 회; 라이트 / 다크 사이클 : 12 h-12 h.
4. 모든 케이지 장비를 소독하고 방사선 조사된 침구를 사용하십시오. 멸균 판지 트레이와 수건을 케이지 내부에 배치하여 케이지 농축을 체계적으로 구현합니다.
5. 제한된 조건 하에서 구역에 대한 접근을 허용합니다: 입구의 새 실험복, 마스크, 장갑, 신발, 헤어 보닛.
6. 재래식 시설에 대한 Felasa 권장 사항에 따라 매년 더러운 침구에 수용된 감시 동물에 대한 군집 건강 모니터링을 수행합니다. 케이지 당 4-5마리의 동물을 적절한 방사선 조사 식단으로 유지하고 산성화된 물을 자유롭게 공급합니다. 매일 모니터링하십시오.
7. 상부 케이지를 여과하는 데 외과적 개입을 위해 선택된 쥐를 수술 2시간 전에 수술실로 옮깁니다.

2. 외과 수술 절차

1. 수술 기구를 준비합니다: 가는 가위, 클램프, 지혈 클램프 2개, 바늘 홀더. 모든 절차에서는 장갑, 마스크, 후드, 실험복을 착용하십시오.
2. 쥐를 무작위로 두 그룹(PRP 및 식염수)으로 나눕니다.
3. 쥐를 우리에서 꺼내 무게를 잰다. 번호가 매겨진 귀 태그를 사용하여 쥐를 식별하십시오. 눈이 건조해지지 않도록 각막에 물방울을 떨어뜨립니다.
4. 자일라진(체중 10mg/kg)과 케타민(체중 80mg/kg)으로 쥐를 복강내 마취합니다. 동물을 심폐 모니터링 하에 두어 마취를 확인하고 눈 반사 신경을 확인합니다.
5. 부프레노르핀 50μL를 목 부위에 진통제로 피하주사(8-12시간마다 0.01-0.05mg/kg)합니다.
6. 전기 면도기로 왼쪽 뒷다리를 면도하고 이소 베타딘/알코올(1:10 희석) 용액을 번갈아 가며 3회 소독한 다음 쥐를 따뜻한 패드(20°C)에 올려 해부 현미경으로 놓습니다. 쥐를 우월한 위치에서 수술할 다리와 함께 측면 욕창에 놓습니다. 수술용 집게로 발을 잡습니다.
7. 가위를 사용하여 왼쪽 아킬레스건을 둘러싼 피부를 작은 측면 절개(20-25mm)하고 가는 가위를 사용하여 근막을 절개하여 아킬레스건 복합체를 노출시킵니다(그림 2a).
8. 가위로 족저근을 제거합니다(그림 2b).
9. 종골 삽입부에 근접한 아킬레스건을 가로로 5mm 자르고 가위를 사용하여 5mm 길이의 부분을 제거합니다. 힘줄을 봉합하지 마십시오(그림 2c, 2d).
10. 흡수성 실로 근막과 피부를 봉합하고 오버제트 봉합사(연속 봉합)를 수행합니다. 모노필라멘트 봉합사는 또한 피부에서 외과 절개 부위로 땀이 빠지는 것을 방지할 수 있습니다.
11. 깨어날 때까지 쥐를 난방 램프 아래에 놓은 다음 쥐를 우리(58 x 38cm)에 다시 넣습니다(참고: 고정은 필요하지 않습니다).

3. PRP 준비

1. 복강내 주사로 자일라진(체중 10mg/kg)과 케타민(체중 80mg/kg)으로 기증자 쥐를 마취합니다. PRP 주사는 재마취제 없이 수술 2시간 후에 실시합니다.
2. 부프레노르핀 50μL를 진통제로 피하주사합니다.
3. 심장 천자로 전혈(쥐당 20mL, 최종 출혈)을 3.2% 완충된 구연산나트륨(0.109M, 항응고제)이 포함된 멸균 튜브에 수집합니다. 그런 다음 심장 주사로 쥐를 안락사시킵니다.
4. PRP를 얻으려면 150 x g과 실온에서 10분 동안 혈액을 원심분리합니다. 이 초기 저속 원심분리 단계는 두 가지 뚜렷한 단계를 생성합니다: 전체 부피의 약 80-90%를 차지하는 적혈구(RBC)로 구성된 낮은 단계와 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)으로 구성된 상위 단계(일반적으로 혈액 샘플의 10-20%).
5. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 보조 플라스틱 튜브에 PRP(상부)를 수집합니다. PRP와 적혈구 사이의 경계면이 매우 느슨하므로 계면에 너무 가까이 피펫팅하지 마십시오. 적절하게 취급할 경우 PRP의 오염된 적혈구는 0.05 x 10³ cells/μL 미만이어야 합니다. 나머지 하상과 1차 채혈관은 폐기합니다.
6. 수집된 PRP의 부피를 측정하고 혈액학 분석기에서 혈소판 수를 측정합니다. 이 값은 다음 단계에서 혈소판 농도를 조정하기 위한 계산에 필요합니다. 혈구 수는 적혈구 및 WBC의 잠재적 오염을 평가하는 데에도 도움이 됩니다. 이 단계에서 PRP의 혈소판 농도는 일반적으로 1 – 1.5 x10⁶/μL입니다.
7. 1,000 x g 및 실온에서 10분 동안 PRP의 두 번째 원심분리를 수행합니다. 이 고속 원심분리 단계는 느슨한 혈소판 펠릿과 자가 혈소판 부족 혈장(PPP)의 상층액을 생성합니다. 3.6단계에서 결정된 값을 사용하여 PRP를 농축하고 최종 농도 2.5 x10⁶/μL에 도달하기 위해 폐기할 상등액의 양을 계산합니다.
8. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 보조 플라스틱 튜브에 상층액(PPP)을 부드럽게 수집하여 3.7단계에서 계산된 최종 부피의 약 2/3를 남깁니다. 펠릿이 느슨해지면 PPP를 폐기할 때 상당한 양의 혈소판이 손실되어 잠재적으로 원하는 농도가 감소할 수 있습니다.
9. 부드럽게 반복되는 피펫팅으로 혈소판 펠릿을 남은 상층액과 함께 조심스럽게 재현탁합니다. 이 농축된 PRP에서 혈소판 수를 측정합니다. 필요한 경우 최종 목표 농도에 도달하기 위해 적절한 양의 자가 PPP를 추가합니다.
   메모: 준비 후 3시간 이내에 PRP를 사용하십시오.
10. PRP mL당 50μL의 CaCl₂(11mEq 10mL)를 추가하여 혈소판을 활성화합니다.
11. 준비 후 약 1시간 후에 50μL의 신선한 PRP 또는 식염수를 21G 바늘과 함께 봉합 수술 부위에 직접 주입합니다. 이 기간 동안 PRP를 실온에서 유지하십시오.
12. 수술 후 며칠 동안과 아킬레스 건을 제거하기 전에 쥐의 기능 회복을 면밀히 모니터링하십시오.

결과

그림 1: 연구의 실험 설계.

그림 2: 수술 절차.

(a) 주변 근막 제거 후의 힘줄 복합체.

(b) 족저근 힘줄 제거.

(c) 아킬레스건 부분 제거.

(d)...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자일라진(Xyl-M)	증권 시세	없음	마 취
케타민 (Jétamine 1000 CEVA)	CEVA 산테 애니멀	없음	마 취
부프레노르핀(Vetergésic Multidosis)	알스토에	없음	진통제
이소-베타딘	MEDA-제약	없음	소독제
흡수성 원사 Vicryl 6/0	존슨앤존슨
넴부탈	CEVA 산테 애니멀	없음	마 취
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148	조직의 구조를 보존합니다.
이소프로판올 100%	폭스바겐	2,09,22,364
에탄올 95%	폭스바겐	2,08,23,362
크실렌	폭스바겐	제28973.363
파라핀	폭스바겐	LEIC3950.1006
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