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1. 폴리(베타 아미노 에스테르)(pBAE) 폴리머와 말단 올리고펩타이드(OM-pBAE)의 합성
- C6-pBAE의 중합
- 5-아미노-1-펜탄올(38mmol; MW = 103.16 Da) 1-헥실아민(38 mmol; MW = 101.19 Da)를 둥근 바닥 유리 플라스크(100mL)에 넣습니다. 그런 다음 1,4-부탄디올 디아크릴레이트(82mmol; MW = 198.22 Da).
- 실리콘 오일 배스를 90°C로 예열하고 둥근 바닥 플라스크를 오일 배스에 넣고 자기 교반 막대를 사용하여 혼합물을 밤새(~18시간) 저어줍니다. 그런 다음 둥근 바닥 플라스크에서 제품을 꺼내 -20 °C의 냉동실에 넣습니다.
메모: 제품은 끈적끈적한 가루 형태이며 주걱을 사용하여 플라스크에서 꺼냅니다. 1H-NMR을 통해 얻어진 고분자의 구조를 검증하는 것이 필수적입니다. NMR 스펙트럼은 클로로포름-d 및D2O를 용매로 사용하여 400MHz 기기(재료 표 참조)에 기록되었습니다. 각 폴리(β-아미노 에스테르) 약 10mg을 취하여 1mL의 중수소화 용매에 용해시켰습니다.
- 펩타이드와 반응하여 OM-pBAE를 얻습니다.
- 0.1M HCl 25mL를 선택한 펩타이드(예: 트리플루오로아세트산이 포함된 펩타이드 Cys-His-His-His-His(TFA, 200mg))에 동결 건조를 견디고 밤새 수동으로 교반하여 맑은 용액을 얻을 수 있는 미리 칭량된 50mL 원심분리 튜브에 추가합니다.
- 용액을 -80°C에서 1시간 동안 동결하고 생성된 펩타이드 하이드로클로라이드를 동결 건조합니다.
참고: 최종 중량이 이론 값에 해당하는지 확인하십시오.
- 디메틸 설폭 사이드에 C6-pBAE (0.031 mmol) 용액을 만듭니다. 또한 디메틸 설폭 사이드에 펩타이드 염산염 (0.078mmol)의 용액을 만드십시오.
- 두 용액을 나사 캡 튜브에 혼합하고 캡을 조입니다. 자기 교반 막대를 사용하여 20시간 동안 25°C의 온도로 제어된 수조에서 혼합물 용액을 저어줍니다.
- 혼합물을 7:3(v/v) 디에틸 에테르/아세톤에 추가합니다. 생성된 현탁액을 4°C에서 25,000 x g에서 원심분리하여 용매를 제거합니다. 다음으로, 7:3 (v/v) 디에틸 에테르/아세톤으로 고체를 두 번 세척합니다. 그런 다음 제품을 진공 상태(<0.2기압)에서 건조시킵니다.
- 디메틸 설폭 사이드에 100 mg / mL의 용액을 만드십시오. 그 결과로 생성된 제품의 이름이 C6-펩타이드-pBAE입니다. 말단 아크릴레이트와 관련된 올레핀 신호의 소실을 확인하기 위해 1H-NMR을 통해 얻어진 고분자의 구조를 검증하는 것이 필수적입니다. 사용하지 않으면 폴리머를 -20°C에서 동결할 수 있습니다.
2. 폴리플렉스 형성
참고: 모든 절차는 일정한 온도를 유지하기 위해 조절된 방 안에서 수행되어야 합니다.
- 폴리머 C6-펩타이드-pBAE를 해동하고 용액을 와류로 가열합니다.
- 폴리머를 위아래로 혼합하고 아세트산 나트륨 (NaAc)에 12.5 mM (V1 )의 용액을 준비합니다. 그런 다음 혼합물을 소용돌이치고 10분 동안 기다립니다.
- 메신저 리보핵산(mRNA)을 0.5mg/mL로 준비하고 (V2).
피펫팅으로 혼합합니다.
메모: mRNA의 와류를 피하는 것이 중요합니다.
- Vortex: 디메틸 설폭사이드(DMSO)의 폴리머 스톡과 아세테이트 완충액 사이의 균질한 용액을 얻기 위해 최종 농도에서 폴리머 혼합물을 와류로 만듭니다.
메모: 최종 고분자 농도는 선택한 N/P(질소 대 인산기) 비율에 따라 달라집니다. N/P 비율은 사용되는 각 특정 mRNA에 따라 다릅니다. 예를 들어, 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP) 캡슐화의 경우 이전에 보고된 바와 같이 25:1 비율이 사용되었습니다.
- 유전 물질 용액과 C6-peptidepBAE 용액(mRNA 농도의 25배)을 1:1(Vi = V1 + V2)의 비율로 혼합합니다.
메모: C6-peptide-pBAE는 마이크로 원심분리 튜브에 로드되며, 여기서 mRNA는 혼합을 위해 위아래로 피펫팅하여 추가됩니다. 준비가 완료되면 폴리플렉스, 핵산 및 C6-펩타이드-pBAE 농도가 절반으로 희석됩니다.
- 25 °C의 열 블록에서 30 분 동안 배양합니다. 물이 담긴 사전 로드된 마이크로 원심분리 튜브에 샘플을 추가하여 1:2 RNase 자유수로 침전시킵니다.
- 부형제를 포함합니다. 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 20mM에 mRNA와 pBAE(VI)의 혼합물과 동일한 부피를 추가하고 상하 피펫팅하여 슈크로스 4%를 추가합니다. 이 시점에서 샘플은 3배 희석되었습니다.
3. 폴리플렉스 동결건조
- 즉시 이전 폴리플렉스 용액의 -80°C 냉동고에서 1시간 동안 동결합니다.
- 다음 단계에 따라 1차 건조를 수행합니다: (1) -60°C 및 0.001hPa에서 1시간; (2) -40 °C 및 0.0001 hPa에서 1 시간; (3) -20 °C 및 0.0001 hPa에서 4 시간; (4) 5°C 및 0.0001hPa에서 12시간.
- 사용할 때까지 재수화를 피하기 위해 즉시 -20 °C에서 보관하십시오.