Affinity Chromatography를 사용한 자체 조립 단백질 나노 입자의 정제

Abstract

출처: Karch, C. P. et al., 삼중결원기 발표가 필요한 백신을 위한 E. coli 발현 자가 조립 단백질 나노 입자 생산.J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 친화성 액체 크로마토그래피를 사용하여 히스티딘 태그가 지정된 자체 조립 단백질 나노 입자 또는 SAPN의 정제를 보여줍니다. 그 결과 정제된 SAPN 분획은 백신 개발에 적합하며 잠재적인 면역 치료 응용 분야에 대한 가능성을 가지고 있습니다.

Protocol

1. 대장균 BL21(DE3)에서 6나선 다발(SHB-SAPN) 단백질을 포함하는 자기 조립 단백질 나노 입자 코어의 발현

1. 제조업체의 지침에 따라 95mL의 성분 A와 매체의 성분 B 5mL를 2L 멸균 유리 삼각 플라스크에 혼합합니다(재료 표 참조). 암피실린을 최종 농도 100μg/mL에 추가합니다.
2. 이전에 확립된 글리세롤 스톡 배양에서 얻은 E. coli를 배지에 접종합니다. 30°C에서 배양물을 48시간 동안 분당 200회전(rpm)으로 흔들면서 배양<> 참고: 사용된 E. coli BL21 (DE3) 스톡에는 SHB-SAPN 유전자를 가진 암피실린 내성 발현 벡터가 포함되어 있습니다. 미디어의 일반적인 프로토콜은 37 ° C에서 24 시간의 배양을 권장하지만 30 ° C에서 48 시간의 배양은 SHB-SAPN에 대한 더 높은 수율을 제공합니다.
3. 배양물을 두 개의 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 4,000 x g에서 4°C에서 고정 각도 로터를 사용하여 10분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 제거하고 펠릿을 저장하여 세포를 수확합니다.
   참고....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2- 프로판올	어부	BP26181	4 리터
암피실린	어부	BP1760-25	25 지
코닝 일회용 진공 필터/보관 시스템	어부	09-761-108	다양한 크기
GE Healthcare 5mL HisTrap HP 사전 포장 컬럼	GE 헬스케어	Tel.45-000-325	5 팩
글리세롤	어부	BP229-4	4 리터
이미다졸	어부	O3196-500	500 지
Magic Media E. coli 발현 매체	써모피셔	K6803	1
MilliporeSigma Millex 멸균 주사기 0.22mm 필터	밀리포어	SLGV033RB	250 개
One Shot BL21 Star (DE3) 화학적 역량 대장	써모피셔	C601003	20 바이알
인산나트륨 Monobasic	어부	BP329-500	500 지
트리스 베이스	어부	BP152-1	1의 kg
요소	어부	BP169-500	2.5kg
설비
Fiberlite F14-14 x 50cy 고정각 로터	써모피셔	제096-145075	회전자
NGC Quest 10 크로마토그래피 시스템	바이오라드	7880001	단백질 정제를 돕는 FPLC
소니퍼 450	브 랜 슨	096-145075라고도 함	초음파 처리기