Affinity Chromatography를 사용한 자체 조립 단백질 나노 입자의 정제

출처: Karch, C. P. et al., 삼중결원기 발표가 필요한 백신을 위한 E. coli 발현 자가 조립 단백질 나노 입자 생산.J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 친화성 액체 크로마토그래피를 사용하여 히스티딘 태그가 지정된 자체 조립 단백질 나노 입자 또는 SAPN의 정제를 보여줍니다. 그 결과 정제된 SAPN 분획은 백신 개발에 적합하며 잠재적인 면역 치료 응용 분야에 대한 가능성을 가지고 있습니다.

1. 대장균 BL21(DE3)에서 6나선 다발(SHB-SAPN) 단백질을 포함하는 자기 조립 단백질 나노 입자 코어의 발현

제조업체의 지침에 따라 95mL의 성분 A와 매체의 성분 B 5mL를 2L 멸균 유리 삼각 플라스크에 혼합합니다(재료 표 참조). 암피실린을 최종 농도 100μg/mL에 추가합니다.
이전에 확립된 글리세롤 스톡 배양에서 얻은 E. coli를 배지에 접종합니다. 30°C에서 배양물을 48시간 동안 분당 200회전(rpm)으로 흔들면서 배양<> 참고: 사용된 E. coli BL21 (DE3) 스톡에는 SHB-SAPN 유전자를 가진 암피실린 내성 발현 벡터가 포함되어 있습니다. 미디어의 일반적인 프로토콜은 37 ° C에서 24 시간의 배양을 권장하지만 30 ° C에서 48 시간의 배양은 SHB-SAPN에 대한 더 높은 수율을 제공합니다.
배양물을 두 개의 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 4,000 x g에서 4°C에서 고정 각도 로터를 사용하여 10분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 제거하고 펠릿을 저장하여 세포를 수확합니다.
참고: 세포 펠릿은 즉시 처리하거나 사용할 때까지 -80°C에서 동결할 수 있습니다.

2. 초음파 처리에 의한 E. coli BL21 (DE3)의 용해

참고: 250°C에서 최소 30분 동안 구운 비발열성 플라스틱 제품 및 유리 제품을 사용하십시오. 환원제인 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)은 단백질 내부 및 단백질 사이의 이황화 결합을 끊습니다. TCEP는 표시된 항원에 S-S 결합이 포함된 경우 이 프로토콜 동안 버퍼에 필요합니다. SHB-SAPN 코어의 경우에만 버퍼에 TCEP가 있어야 하는 것은 아닙니다.

이미다졸이 없는 완충액(8M 요소, 50mM 인산나트륨 일염기성, 20mM 트리스 염기, 5mM TCEP) pH 8.0(5N 수산화나트륨, NaOH로 조정)을 준비하고 0.22μm 진공 병 여과 장치를 사용하여 여과합니다.
펠릿화된 세포(단계 1.3)를 50mL 코니컬 튜브 1개에 40mL의 이미다졸이 없는 완충액으로 재현탁합니다. 150W의 초음파 출력으로 5 분 (초음파 처리 4 초, 휴식 6 초) 동안 얼음 위에서 프로브로 재현 탁 된 세포를 초음파 처리합니다.
세포 용해물(40mL)을 29,000 x g, 4°C에서 25분 동안 고정각 로터에서 25분 동안 원심분리하여 정화된 상층액을 생성합니다. 상등액을 150mL 멸균 플라스크에 옮기고 펠릿을 버립니다. 이미다졸이 없는 완충액(프로토콜에서 나중에 "샘플"이라고 함)을 사용하여 상등액을 100mL로 희석합니다.
참고: 이 희석 단계는 컬럼에서 용해물을 로딩하는 동안 빠른 성능의 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템 압력이 너무 높아지는 것을 방지하기 위해 필요합니다.

3. His-column을 사용한 단백질 정제

참고: 이 프로토콜은 FPLC 기기를 사용하여 수행되었지만 중력 흐름에 맞게 조정할 수 있습니다.

다음 완충액을 준비하고 0.22μm 진공 병 여과 장치를 사용하여 여과합니다: (i) 이미다졸이 없는 완충액 "완충액 A"(8M 요소, 50mM 인산나트륨 일염기성, 20mM 트리스 염기, 5mM TCEP) pH 8.0; (ii) 500 mM 이미다졸 완충액 "완충액 B" (8 M 요소, 50 mM 인산나트륨 일염기성, 20 mM 트리스 염기, 5 mM TCEP, 500 mM 이미다졸) pH 8.0; 및 (iii) 이소프로판올 세척(20mM Tris, 60% 이소프로판올) pH 8.0.
참고 : 각 버퍼에 대한 pH는 5 N NaOH로 조정되었습니다.
His-column.
평형 참고: 실험실 규모 생산의 경우 이 프로토콜은 5mL의 사전 충전된 His-컬럼을 사용하지만 더 큰 크기의 컬럼을 사용할 수 있습니다.
1. FPLC 소프트웨어를 열고 새 방법 옵션을 클릭합니다. 즉시 방법 설정 메뉴가 열립니다. 열 위치에 대한 드롭다운 메뉴에서 C1 포트 3을 선택합니다.
2. Shown by technique(기술별로 표시) 드롭다운 메뉴에서 affinity(어피니티)를 선택합니다. 컬럼 유형 드롭다운 메뉴에서 기타, Histrap HP, 5mL를 선택합니다. 열 볼륨과 압력 상자는 자동으로 적절한 값으로 설정됩니다.
3. 방법 개요 버튼을 클릭합니다. Phase library(위상 라이브러리) 팝업 메뉴에서 Equilibration(평형), Sample Application(시료 Application), column wash(컬럼 세척) 및 elution(용리) 버튼을 정확한 순서로 화살표 옆의 버튼으로 드래그합니다. Phase library 메뉴를 닫습니다.
4. 평형 버튼을 클릭합니다. 표에 나열된 값은 "초기 버퍼 B"(4%), "최종 버퍼 B"(4%) 및 "볼륨(CV)" 5이어야 합니다.
5. Sample application(샘플 응용 프로그램) 상자를 클릭합니다. Sample loading(샘플 로딩) 상자에서 Inject sample on column with sample pump(샘플 펌프가 있는 열에 샘플 주입) 라디오 버튼을 클릭합니다. Use flow rate from method settings 옆의 상자가 시스템 펌프를 사용한 시료 주입 상자에서 선택되어 있는지 확인합니다. 화면 오른쪽의 볼륨 상자 옆에서 값을 20mL로 변경합니다.
6. Column wash 버튼을 클릭합니다. 표에 나열된 값은 "초기 버퍼 B"(4%), "최종 버퍼 B"(4%) 및 "볼륨(CV)" 5이어야 합니다. fraction collection scheme(분획 수집 체계) 옆에 있는 Enable(사용) 상자를 클릭 해제합니다.
7. 용리 버튼을 클릭합니다. 표에 나열된 값은 "초기 버퍼 B" 0%, "최종 버퍼 B" 100% 및 "볼륨(CV)" 5이어야 합니다. fraction collection scheme(분획 수집 체계) 옆에 있는 Enable(활성화) 상자를 클릭합니다. Use fraction size from Method(분석법 설정의 분획 크기 사용) 설정을 클릭 해제하고 아래 채우기 상자에서 분획 크기를 4mL로 조정합니다.
8. 소프트웨어 상단의 다른 이름으로 저장 버튼을 클릭합니다. 파일 이름을 "equilibration"으로 지정합니다.
9. 5mL의 사전 포장된 His 컬럼을 FPLC의 해당 컬럼 포트 3에 연결합니다. 펌프 A와 펌프 B 튜빙, 그리고 샘플 펌프 튜빙은 0.22μm의 여과된 탈이온수에 넣어야 합니다. 평형 프로그램을 실행합니다.
10. 펌프 A와 펌프 B, 그리고 샘플 펌프 튜브를 이미다졸이 없는 버퍼(버퍼 A)에 넣고 평형 프로토콜을 다시 실행합니다.
샘플을 컬럼에 결합하고 단백질을 정제합니다.
1. FPLC 소프트웨어를 열고 새 방법 옵션을 클릭합니다. 즉시 방법 설정 메뉴가 열립니다. Column(열)의 드롭다운 메뉴에서 C1 포트 3을 선택합니다. Shown by technique(기술별 표시) 드롭다운 메뉴에서 affinity(어피니티)를 선택합니다. 컬럼 유형 드롭다운 메뉴에서 기타, Histrap HP, 5mL를 선택합니다. 열 볼륨과 압력 상자는 자동으로 적절한 값으로 설정됩니다.
2. 방법 개요 버튼을 클릭합니다. 위상 라이브러리(Phase library) 팝업 메뉴에서 버튼을 드래그합니다: Equilibration, sample application, column wash(Wash 1), column wash(Wash 2), column wash(Wash 3) 및 Elution을 화살표 옆의 정확한 순서로 드래그합니다. Phase library 메뉴를 닫습니다.
3. Equilibration 버튼을 클릭합니다. 표에 나열된 값은 "초기 버퍼 B" 4%, "최종 버퍼 B" 4% 및 "볼륨(CV)" 5여야 합니다.
4. Sample application(샘플 응용 프로그램) 상자를 클릭합니다. Sample loading 상자에서,Sample Pump가 있는 열에 있는 I nject sample에 대한 라디오 버튼을 클릭합니다. Use flow rate from method settings(분석법의 유속 사용) 옆의 상자가 시스템 펌프를 사용한 시료 주입 상자에서 선택되어 있는지 확인합니다.
5. 화면 오른쪽의 볼륨 상자 옆에 있는 값을 100mL로 변경합니다. fraction collection scheme(분획 수집 체계) 옆에 있는 Enable(사용) 버튼을 클릭합니다. Method 설정 상자에서 Use fraction size(분획 크기 사용)를 클릭 해제한 다음 분획 크기를 4mL로 변경합니다.
6. 첫 번째 열 세척 버튼(Wash 1)을 클릭합니다. 표에 나열된 값은 "초기 버퍼 B" 4%, "최종 버퍼 B" 4% 및 "볼륨(CV)" 10이어야 합니다. fraction collection scheme(분획 수집 체계) 옆에 있는 Enable(사용) 상자를 클릭합니다. Use fraction size from Method(분석법 설정의 분획 크기 사용)를 클릭 해제한 다음 분획 크기를 4mL로 변경합니다.
7. 두 번째 열 세척 버튼(세척 2)을 클릭합니다. 표에 나열된 값은 "초기 버퍼 B" 0%, "최종 버퍼 B" 0% 및 "볼륨(CV)" 5이어야 합니다. fraction collection scheme(분획 수집 체계) 옆에 있는 Enable(사용) 상자를 클릭합니다. Use fraction size from Method(분석법 설정의 분획 크기 사용)를 클릭 해제한 다음 분획 크기를 4mL로 변경합니다.
8. 세 번째 열 세척 버튼(세척 3)을 클릭합니다. 표에 나열된 값은 "초기 버퍼 B" 0%, "최종 버퍼 B" 0% 및 "볼륨(CV)" 5이어야 합니다. Fraction Collection scheme(분획 수집 체계) 옆에 있는 Enable(활성화)을 클릭합니다. Method 설정 상자에서 Use fraction size(분획 크기 사용)를 클릭 해제한 다음 분획 크기를 4mL로 변경합니다.
9. Elution 버튼을 클릭합니다. 오른쪽 표에서 나열된 정보를 클릭하고 나타나는 메뉴에서 삭제 단계를 클릭합니다. isocratic gradient 버튼을 테이블로 두 번 드래그하여 두 개의 항목이 있도록 합니다.
10. 첫 번째 항목의 값은 "초기 버퍼 B" 30%, "최종 버퍼 B" 30% 및 "볼륨(CV)" 10이어야 합니다. 두 번째 항목의 값은 "초기 버퍼 B" 100%, "최종 버퍼 B" 100% 및 "볼륨(CV)" 10이어야 합니다. fraction collection scheme(분획 수집 체계) 옆에 있는 Enable(사용) 버튼을 클릭합니다. Use fraction size from method settings(방법 설정에서 분수 크기 사용) 옆의 상자를 클릭합니다.
11. 소프트웨어 상단의 저장 버튼을 클릭합니다. 파일 이름을 "purification"으로 지정합니다. FPLC의 펌프 A 튜빙은 이미다졸이 없는 세척 버퍼에 삽입해야 하며, 펌프 B 튜빙은 500mM 이미다졸 버퍼에 삽입해야 합니다. 샘플 펌프 튜브는 100mL 샘플에 넣어야 합니다.
12. "정제" 프로그램을 실행하고 60% 이소프로판올이 필요한 시간을 기다립니다(세척 2). 프로그램을 일시 중지하십시오. 펌프 A 튜브를 이미다졸이 없는 세척에서 60% 이소프로판올 세척으로 이동합니다. 프로그램을 다시 시작합니다.
13. 이소프로판올 단계가 완료되면 프로그램을 다시 일시 중지하고 펌프 A 튜브로 이동하여 이미다졸이 없는 세척 버퍼로 다시 이동합니다. 정제 프로그램을 다시 시작합니다(나머지 실행은 자동화됨).

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2- 프로판올	어부	BP26181	4 리터
암피실린	어부	BP1760-25	25 지
코닝 일회용 진공 필터/보관 시스템	어부	09-761-108	다양한 크기
GE Healthcare 5mL HisTrap HP 사전 포장 컬럼	GE 헬스케어	Tel.45-000-325	5 팩
글리세롤	어부	BP229-4	4 리터
이미다졸	어부	O3196-500	500 지
Magic Media E. coli 발현 매체	써모피셔	K6803	1
MilliporeSigma Millex 멸균 주사기 0.22mm 필터	밀리포어	SLGV033RB	250 개
One Shot BL21 Star (DE3) 화학적 역량 대장	써모피셔	C601003	20 바이알
인산나트륨 Monobasic	어부	BP329-500	500 지
트리스 베이스	어부	BP152-1	1의 kg
요소	어부	BP169-500	2.5kg
설비
Fiberlite F14-14 x 50cy 고정각 로터	써모피셔	제096-145075	회전자
NGC Quest 10 크로마토그래피 시스템	바이오라드	7880001	단백질 정제를 돕는 FPLC
소니퍼 450	브 랜 슨	096-145075라고도 함	초음파 처리기

Affinity Chromatography를 사용한 자체 조립 단백질 나노 입자의 정제

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