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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. CD4 키메라 항원 수용체로 설계된 인간화 마우스의 구성
- 태아 흉선 처리 및 태아 간에서 CD34+ HSC 분리
- 흉선 가공
- 15ml 원뿔형 튜브에 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4로 흉선을 부드럽게 씻습니다. 세탁 단계를 3-4회 반복합니다.
- 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 배지 7ml + 소 태아 혈청(FBS) 10% + 페니실린/스트렙토마이신(펜/연쇄상구균)을 추가합니다. 모든 것을 멸균 100mm 페트리 접시에 넣으십시오.
- 메스를 사용하여 흉선을 약 1mm2의 작은 조각으로 자릅니다. 96웰 플레이트의 단일 웰에 있는 모든 흉선 조각을 놓습니다. 흉선 조각을 96웰 플레이트로 옮길 때 구부러진 뭉툭한 집게를 사용하십시오.
- 조직이 건조되지 않도록 모든 웰에 소량의 배지(100 - 200 μl)를 추가합니다. 현미경으로 시각화 (흉선에는 엽이 있으며 세포 자루처럼 보여야 함).
메모: 어떤 식으로든 의심스러워 보이는 조각은 버리십시오. 종종 결합 조직이 있으며 이를 이식해서는 안 됩니다.
- 확인된 흉선 조각을 제거하고 모두 T25 세포 배양 플라스크에 넣습니다. 10% FBS가 보충된 7ml RPMI 배지와 450μg/ml의 피페라실린/타조박탐 및 암포테리신 B를 추가합니다. 플라스크를 부드럽게 섞습니다. 37ºC/5% CO2.
에서 밤새 플라스크를 배양합니다.
메모: 이 단계는 조직의 박테리아 오염을 방지하기 위해 필요합니다.
- (선택 단계) 나중에 사용할 수 있도록 흉선을 얼립니다. 90% Human AB Serum의 덩어리를 10% Dimethyl sulfoxide(DMSO)로 10분 동안 평형을 이룹니다. 1ºC/min에서 -50ºC까지 동결한 다음 -150ºC로 급속 냉각합니다. 해동할 준비가 되면 37ºC 수조에서 빠르게 해동하고 DMSO 없이 RPMI 완전 매체에서 3번 부드럽게 세척합니다.
- 간 처리
- 50ml 원뿔형 튜브에 PBS로 간을 부드럽게 씻습니다. 세탁 단계를 3-4회 반복합니다.
- 10ml Iscove의 Modified Dulbecco Media(IMDM)를 50ml 원뿔형 튜브에 추가합니다. 모든 것을 100mm 멸균 페트리 접시에 넣으십시오.
- 두 개의 메스를 사용하여 간 조직을 균질화합니다. 간을 약 3mm2의 작은 조각으로 자릅니다. 흰색 결합 조직을 잘라내어 버리십시오.
- 16게이지 뭉툭한 바늘이 장착된 10ml 주사기를 사용하여 간 조각과 매체를 흡수합니다. 그런 다음 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.
- 매체 및 조직 현탁액을 재현탁시키고 조직을 완전히 균질화하기 위해 5-7회 더 배출합니다.
- 효소가 보충된 10ml IMDM 배지를 준비합니다: 500 U/ml 콜라겐 분해 효소, 2,400 U/ml 히알루로니다아제 및 300 U/ml DNase, 450 μg/ml 피페라실린/타조박탐 및 암포테리신 B. 0.22 μm 필터를 통해 배지를 여과한 다음 배지를 간 현탁액에 추가합니다.
- 간 현탁액이 들어 있는 50ml 원추형 튜브의 뚜껑을 덮고 누출을 방지하기 위해 파라필름과 같은 자체 밀봉 필름으로 단단히 밀봉합니다. 인큐베이터의 튜브 로테이터를 37ºC에서 90분 동안 회전시킵니다.
- 100μm 세포 여과기를 통해 분해된 세포 현탁액을 새 50ml 튜브로 여과합니다.
메모: 현탁액에 PBS를 추가하여 총 부피를 50ml로 늘립니다. 이것을 각각 25ml의 세포 현탁액을 포함하는 두 개의 50ml 튜브로 나눕니다.
- 각 튜브의 세포를 10ml 밀도의 원심분리 매체(예: Ficoll)로 천천히 부드럽게 깔아줍니다. 브레이크 없이 1,200 x g로 20분 동안 회전합니다. 참고: 이 프로토콜에 언급된 모든 원심분리는 실온(25ºC)에서 수행됩니다.
- 각 튜브에서 인터페이스(즉, 버피 코트)를 조심스럽게 제거하고 두 개의 별도 50ml 튜브로 옮깁니다. PBS를 사용하여 인터페이스의 각 튜브의 부피를 최대 50ml까지 가져옵니다. 300 x g에서 7 - 10분 동안 회전합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오.
- 두 펠릿을 결합하십시오. 2% FBS가 함유된 50ml PBS로 3회 더 씻습니다. 300 x g에서 각각 7 - 10분 동안 회전하면서 상층액을 조심스럽게 흡입합니다.
- 펠릿을 50ml RPMI 배지 + 10% FBS에 재현탁합니다. 세포 분류를 진행하기 전에 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 CD34 분류 키트(예: CD34 마이크로 비드)를 사용하여 CD34+ 셀을 즉시 분류합니다.
메모: 또는 RPMI 배지 + 10% FBS에서 100만/ml로 하룻밤 동안 세포를 배양할 수 있습니다.
- CD34+ 및 CD34- 분수를 모두 저장합니다.
메모: 이 단계에서 CD34+ 및 CD34- 세포는 Bambanker 동결 매체 또는 기타 동결 매체를 사용하여 동결할 수 있습니다. 튜브당 4 - 6 x 106 CD34+ 세포 1ml를 동결하고 튜브당 40 - 60 x 106 CD34- 세포 1ml를 동결합니다.
- CD34+ 세포의 형질도입
- 6-well-tissue-culture plate에 필요한 transduction well의 수를 계산합니다. 하나의 웰을 사용하여 최대 8 x 106 세포를 형질도입할 수 있습니다. 각 골수/간/흉선(BLT) 마우스에 대해 0.5 x 106 CD34+ 세포를 CD34- 세포 및 흉선과 함께 신장 캡슐 아래에 이식하고 0.5 x 106 CD34+ 세포를 정맥 주사합니다. 사용할 CD34+ 세포의 수는 마우스의 수(마우스당 100만 개의 세포)에 따라 결정됩니다.
- 필요한 수의 비조직 배양 처리된 6웰 플레이트 웰을 1.25ml의 재조합 인간 피브로넥틴 용액(예: 레트로넥틴)(PBS의 경우 20μg/ml)으로 각 웰에 코팅합니다. 플레이트를 덮고 깨끗한 생물 안전 캐비닛에서 실온에서 2시간 동안 그대로 두십시오.
- 웰에서 피브로넥틴 용액을 흡인하고 차단을 위해 각 웰에 1.25ml의 FACS(Fluorescence-activated Cell Sorting) 완충액(4% FBS가 포함된 PBS)을 추가합니다. 접시를 실온(25ºC)에서 30분 동안 그대로 두십시오.
- FACS 버퍼를 흡입하고 PBS로 웰을 한 번 세척합니다.
- 플레이트를 사용할 준비가 될 때까지 코팅된 웰에 PBS를 보관하십시오. 즉시 사용하지 않을 경우 플레이트를 4ºC에서 밤새 보관하십시오.
- CD34+ 세포를 피브로넥틴 용액으로 코팅된 웰(~2 x 10,6 cells/ml)의 감염 배지(Yssel의 무혈청 T 세포 배지의 2% 인간 혈청 알부민)에 플레이트화하고 37ºC에서 1시간 동안 배양합니다.
- 피펫을 사용하여 2 - 10 사이의 감염 다중성(MOI)에서 웰에 렌티바이러스 벡터를 추가합니다. 부드럽게 섞어 37ºC에서 밤새 배양합니다 .
메모: 사용된 렌티바이러스 벡터의 역가는 사전에 결정해야 합니다.
- 다음 날 세포 스크레이퍼로 우물 바닥을 부드럽게 긁어 세포를 수확합니다. 세포를 수집하고 혈구계로 계수합니다.
- 임플란트를 위한 세포를 준비하기 위해 0.5 x 106 형질도입된 CD34+ 세포를 마우스당 4.5 x 106 CD34- 세포와 결합하고 분취량을 멸균 1.5ml 스크류 캡 튜브에 넣습니다. 세포를 300 x g에서 펠릿으로 스핀다운하고 상층액을 흡입합니다. 300 x g에서 다시 돌리고, P10 파이펫을 사용하여 남아 있는 상층액을 흡인하고, 매우 조심스럽게 흡인합니다. 연구하는 동안 마른 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오. 메모: 세포가 생존할 수 있도록 펠릿화된 세포를 사용하고 2-3시간 이내에 수술을 수행합니다.
- 주입을 위한 세포를 준비하기 위해 마우스당 0.5 x 106개의 형질도입된 CD34+ 세포를 스핀하여 상층액을 펠릿화하고 흡인합니다. 마우스당 100μl RPMI 배지에 세포를 재현탁하고 얼음 위에 보관합니다.
- 형질도입 효율을 확인하기 위해 각 조건 및 배양에서 ~1 x 105개의 비형질도입 및 형질도입된 CD34+ 세포를 96웰 플레이트의 96웰 플레이트에서 37ºC에서 5 - 7일 동안 분취합니다.
메모: 이 단계에서 사용되는 세포는 수술에 사용되는 것이 아니라 transduction이 성공적으로 이루어지고 벡터가 줄기 세포의 생존 및 재생에 독성이 없는지 확인하기 위해 사용됩니다. transduction efficiency는 벡터의 유전자 발현(예: GFP&CD4)을 찾아 확인하고 유세포 분석으로 분석할 수 있습니다.
- 유전자 조작 마우스를 구성하기 위한 조직 이식
- 수술 전날 NOD의 전신 조사가 수행됩니다. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Cesium-137 조사기와 2.7 Gy (270Rad)의 용량을 가진 면역 저하 마우스.
메모: NSG 마우스는 면역이 심각하게 저하되어 있습니다. 따라서 그들의 주거와 유지 관리는 가장 높은 건강 기준을 준수해야 하며 고도로 훈련된 직원이 처리해야 합니다.
- 플라스크에서 흉선 조각과 매체를 60mm 접시에 붓습니다. PBS를 다른 60mm 접시에 붓면 트로카를 청소하고 신장을 적신 상태로 유지하는 데 사용됩니다.
- 용적식 피펫 팁을 얼음 위의 열린 1.5ml 멸균 스크류 캡 튜브에 넣어 냉각시킵니다. 건조된 세포 펠릿과 Matrigel.
와 같은 젤라틴 단백질 혼합물과 함께 얼음에 보관하십시오.
메모: 임플란트 바늘이 장착될 때까지 젤라틴 단백질 혼합물과 접촉하는 튜브 또는 팁을 차갑게 유지하는 것이 중요합니다.
- 생쥐 마취: 생쥐의 무게를 개별적으로 측정하고 무게를 기록한다. 생쥐의 수를 매기기 위해 귀를 때린다. 체중 1g당 15μl의 케타민(식염수 2.6mg/ml)/자일라진(식염수 100mg/ml)을 복강내 주사합니다. 쥐를 다시 케이지에 넣고 완전히 마취될 때까지 기다립니다.
메모: 발을 쥐어 마우스의 마취 수준을 확인하십시오. 마우스가 반사적으로 움찔하면 케타민/자일라진의 원래 양의 25-50%를 투여하여 마우스를 추가로 마취합니다. 반사적으로 움찔하지 않을 때까지 기다렸다가 수술을 합니다.
- Oster 클리퍼(면도기)를 사용하여 각 마우스의 왼쪽을 엉덩이부터 어깨까지 등 중앙과 배 사이에서 면도합니다. 희석된 카프로펜 0.3ml(6mg/kg)를 동물의 어깨 또는 서혜부 삼각형(다리 구멍)에 피하주사합니다. 면봉을 사용하여 인공 눈물을 각 눈에 작은 방울 떨어뜨리고 마우스를 옆으로 눕혀 케이지에 다시 눕힙니다.
메모: 수술 준비를 한 번에 하나의 케이지(약 4 - 5마리의 마우스)로 제한하십시오.
- 16게이지 암 임플란트 바늘(투관침)의 캐뉼라를 PBS로 세척합니다. 한 쌍의 뭉툭한 곡선 집게를 사용하여 60mm 접시의 흉선 조각을 개구부 바로 안쪽에 투관침이 있는 캐뉼라 개구부에 넣은 다음 투관침을 뒤로 당겨 조직을 캐뉼라로 흡인합니다.
- 용적치환 피펫과 냉각된 팁을 사용하여 건조된 세포 펠릿(이식된 세포의 경우 CD34+ 및 CD34- 혼합물)과 함께 5μl의 차가운 젤라틴 단백질 혼합물을 튜브에 넣고 부드럽게 저어 세포 현탁액을 생성합니다. 위아래로 피펫팅하지 마십시오. 젤라틴 단백질 혼합물 / 세포 현탁액을 캐뉼라의 개구부에 피펫으로 넣고 침을 적재하기 위해 투관침을 천천히 뒤로 당깁니다 .
메모: 임플란트 바늘을 조작하는 동안 피펫을 로드할 도우미를 두는 것이 좋습니다.
- 마우스의 면도한 부위를 포비돈 요오드로 면봉으로 닦은 다음 알코올 물티슈로 해당 부위를 세 번 닦습니다. 피부 아래의 가장 어두운 부분을 확인하십시오. 이것은 비장의 위치를 나타냅니다. 신장은 비장에서 약 5mm 등쪽입니다. 구부러진 집게로 피부를 들어 올리고 비장과 평행한 피부를 수술용 가위로 15mm 길이로 절개합니다. 그런 다음 아래 복막층을 비슷하게 자릅니다. 남성의 경우 신장이 쉽게 보여야 하며 복부를 누르기만 하면 돌출시킬 수 있습니다. 지혈 또는 구부러진 뭉툭한 집게로 신장을 지지할 수 있습니다. 여성의 경우 난소가 신장을 쉽게 추출하지 못하도록 막는 경향이 있습니다. 지혈제를 사용하여 난소를 집어 올리고 조심스럽게 신장을 노출시킵니다.
- 바늘 끝이 있는 집게를 사용하여 신장 캡슐의 뒤쪽 끝에 있는 작은 구멍을 뽑습니다.
메모: 이 바늘 끝이 있는 집게를 사용하여 생물학적 위험 물질을 취급하지 마십시오.
- 캐뉼라의 입구가 신장 캡슐로 완전히 덮일 때까지 임플란트 바늘을 이 구멍과 신장을 따라 밀어 넣습니다.
- 신장 캡슐 아래의 조직을 부드럽게 밀어내고 바늘을 다시 당겨 빼냅니다. 흉선 조각은 끈적할 수 있으므로 구부러진 집게를 사용하여 흉선 조각이 바늘과 함께 나오지 않도록 하십시오.
- 겸자로 복막을 들어 올리고 지혈을 부드럽게 사용하여 신장을 제자리로 밀어 넣습니다. 4-0 비크릴 흡수성 봉합사를 사용하여 복막에 이중 매듭 스티치 하나를 묶습니다. 두 개의 Autoclips 상처 클립을 사용하여 피부를 닫습니다.
- 주입을 위해 따로 보관된 형질도입된 CD34+ 세포를 혼합하고 100μl(0.5x10,6개 세포)를 인슐린 주사기에 흡수합니다. 이 세포를 후안와 정맥 주입 또는 다른 정맥 주사 경로를 통해 마우스에 주입합니다. 면봉을 사용하여 인공 눈물을 각 눈에 작은 방울 떨어뜨리고 마우스를 옆으로 눕혀 케이지에 다시 눕힙니다.
- 모든 쥐가 이식되면 동물이 의식을 되찾고 정상적으로 보행하는지 확인한 후 떠나기 전에 이동합니다.
- 수술 후 관리: 수술 다음날 각 마우스에 희석된 카프로펜 0.3ml(6mg/kg)와 멸균 식염수 1.2ml를 피하 주사합니다.수술 후 2일 및 3일 후에 각 마우스에 멸균 식염수 1.5ml를 피하 주사합니다. 수술 후 10-14일 동안 생쥐와 절개 부위를 모니터링합니다. Autoclips를 제거하고 10-14일 후에 마우스의 무게를 잰다. 메모: 생쥐는 방사선 투여 후 몸이 느려지며 식염수 주사는 동물의 탈수를 방지합니다.
- 8-10주 후, 마우스의 출혈을 통해 말초 혈액에 대한 FACS 분석을 실시하고 CD45, CD3, CD4, CD8 및 벡터가 발현해야 하는 모든 유전자를 염색하여 생착을 확인합니다.