Bone Marrow Stem Cells에서 원형질막 소포 생성

Abstract

출처: Xu, L. et al., Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy(잠재적인 세포질 대체 요법을 위한 골수 중간엽 줄기세포의 원형질막 소포 준비).J. Vis. 특급 (2017)

이 동영상은 골수 줄기세포를 멤브레인 필터에 빠르게 통과시켜 원형질막 소포를 생성하는 방법을 보여줍니다. 이러한 PMV는 세포질 대체 요법의 잠재력을 보여줍니다.

Protocol

1. 장치의 조립

1. 무균 상태를 보장하려면 사용하기 전에 조직 배양 후드의 자외선(UV)을 30분 동안 켜십시오.
2. 일회용 25mm 필터 장치의 나사를 풀고 장치의 캡과 바닥을 75% 에탄올로 채워진 200mL 유리 컵에 30분 동안 담그십시오. 이 장치는 의료용 폴리프로필렌으로 만들어졌습니다.
3. 집게를 사용하여 장치의 캡과 바닥을 잡고 남은 에탄올을 손으로 털어낸 다음 후드에서 부품을 10분 동안 자연 건조시킵니다.
4. 19mm 폴리카보네이트 멤브레인을 인산염 완충 식염수(PBS)에 적시고 장치 바닥의 지지 매트릭스 위에 조심스럽게 놓습니다. 폴리머 필름은 매끄럽고 평평한 표면과 트랙 에칭 된 3μm 기공을 가지고 있습니다.
5. 캡을 바닥에 단단히 조여 장치를 재조립합니다. 멤브레인이 중앙에서 이탈하지 않았는지 확인하십시오.
6. 1mL 인슐린 주사기의 바늘을 제거하고 PBS 1mL를 뽑습니다. 주사기를 필터 장치에 부착한 다음 장치를 통해 PBS를 밀어 어셈블리를 적시고 누출이 있는지 테스트합니다.

2. 원형질막소포(PMV)의 생성

1. 15%의 소 태아 혈청(FBS)과 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) 배양 배지에서 Nemeth 등이 보고한 바와 같이 골수 중간엽 줄기세포(BMSC) 배양을 확립합니다. 37°C에서 5% CO₂를 함유하는 가습된 인큐베이터의 6웰 플레이트에서 세포를 배양합니다.
2. 세포를 증식시키려면 배양 배지를 제거하고 0.5mL의 칼슘이 없는 PBS로 웰을 헹굽니다.
3. 0.25% 트립신-에틸렌디아민 테트라아세트산(트립신-EDTA) 0.5mL를 추가하고 37°C에서 3분 동안 세포를 배양합니다. 세포 분리를 용이하게 하기 위해 플레이트를 손바닥에 두어 번 두드립니다. 배양 배지 1mL를 첨가하여 분해를 중지합니다.
4. 15mL 코니컬 튜브에 세포를 모으고 벤치탑 원심분리기에서 2분 동안 200 x g로 회전합니다. 4mL의 배양 배지에 세포를 재현탁시키고 세포를 6웰 플레이트의 2웰로 분취합니다.
   메모: 세포는 일반적으로 약 24시간에 합류점에 도달합니다.
5. PMV를 생성하기 위해 트립신 분해를 통해 6-well plate의 1웰(약 5 x 10⁵ 세포)에서 세포를 수확하고 0.5mL의 배양 배지에서 세포를 단분산합니다.
6. 인슐린 주사기에 세포를 넣고 필터 장치에 부착한 다음 플런저를 빠르게 밀어 필터를 통해 세포를 짜냅니다. 압출된 매체 내부에는 PMV가 몇 개만 있어야 하므로 폐기하십시오.
7. 0.5mL의 배지를 주사기에 추가로 로드하고 필터를 통해 빠르게 밀어 넣습니다. 다양한 크기의 PMV를 포함하는 두 번째 압출의 매체를 수집했습니다.
8. 수집된 배지 150μL를 35mm 유리 바닥 접시에 넣고 PMV가 약 10분 동안 바닥에 가라앉도록 합니다. 20X 대물 렌즈를 사용하여 CCD 카메라가 장착된 반전 위상차 현미경으로 PMV를 검사합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IsoporeTM 멤브레인	밀리포어	TSTP04700	3mm 기공
일회용 필터 장치	Xinya, 상하이, 중국	25의 mm	의료용 폴리프로필렌
인슐린 주사기	BD (영어)	328446	1 밀리리터