항혈인성 종양 관련 호중구 생성

초록

출처: Pylaeva, E., et al. In vivo를 연구하기 위해 조작된 종양 관련 호중구를 종양 보유 마우스로 이식. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 항혈관신생 종양 관련 호중구(TAN)를 생성하는 분석을 보여줍니다. pro-angiogenic TAN을 포함하는 쥐 흑색종 종양을 채취하면 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 단일 세포를 분리하고 NIPOMAMIDE phosphoribosyl transferase(NAMPT) 억제제로 처리하여 혈관 신생을 자극하는 능력을 줄입니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

참고: 프로토콜의 전체 체계는 그림 1에 나와 있습니다.

1. B16F10 흑색종 세포주의 제조

1. 완전한 Iscove의 Modified Dulbecco's Medium(IMDMc: IMDM + 10% Fetal Bovine Serum (FBS) + 1% penicillin-streptomycin)에서 90% confluent monolayer(약 10 x 10⁶ cells/T75 flask)로 성장한 마이코플라스마 음성 세포를 준비합니다.
2. 배지를 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 헹굽니다. 단백질 분해 효소 및 콜라겐 분해 효소가 함유된 세포 분리 용액 6mL를 바르고(재료 표 참조) 37°C에서 2분 동안 배양합니다.
3. 플라스크를 부드럽게 두드려 바닥에서 남아 있는 부착 세포를 동원합니다. 15mL 튜브에 세포 현탁액을 넣고 300 x g에서 7분 및 20°C 동안 원심분리합니다.
4. 상등액을 제거하고 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁합니다. PBS 14mL와 원심분리기(300 x g 및 20°C에서 7분 동안)를 추가합니다.
5. 상등액을 제거하고 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁합니다.
6. 세포를 계수하고 주입을 위해 3 x 10⁶/mL PBS(단계 2의 경우) 또는 6 x 10⁶/mL PBS(단계 6의 경우) 농도로 재현탁합니다. 세포를 최대 30분 동안 얼음 위에 두십시오.

2. 마우스의 동종 종양 모델

1. 특정 병원체가 없는(SPF) 조건에서 보관되는 8-12주 된 암컷 Ifnar1-/- 마우스 10마리를 사용하십시오.
   메모: 암컷 마우스는 종양 성장의 피하 모델에서 선호되는데, 이는 수컷이 더 공격적이고 따라서 종양 성장에 영향을 미치는 종양 부위를 위반하는 경향이 있기 때문입니다.
2. 전기 면도기로 마우스의 옆구리 피부를 면도하고 70 % 에탄올로 적신 조직으로 피부를 소독합니다.
3. 준비된 B16F10 흑색종 세포를 1 mL 주사기와 0.4 x 19 mm 바늘에 3 x 10⁶/mL PBS(단계 1 참조) 농도로 수집합니다. 현탁액 100μL를 피하로 주입합니다.
   1. 모든 주사 전에 세포를 잘 혼합하십시오. 종양 세포를 방해하지 않도록 직경 0.4mm 이상의 바늘을 사용하십시오.
4. 하나의 케이지에 최대 5마리의 마우스를 배치하고 14일 동안 캘리퍼로 종양 크기(길이, 너비 및 깊이)를 제어합니다.
   메모: 동물 규정에 따르면 종양의 직경이 15mm를 초과해서는 안 되며, 종양이 크거나 괴사성/개방성 종양이 있는 마우스는 미리 희생해야 합니다.
5. 14일째에 CO₂ 챔버에 있는 쥐를 희생합니다.
6. 70% 에탄올로 피부를 소독하고 멸균 페트리 접시에 가위와 집게로 종양을 제거합니다. 얼음 위에서 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신)을 완전히 사용하여 50mL 튜브에 종양을 보관합니다.

3. TAN 절연

1. 종양을 멸균 6-well 플레이트에 배치하고 well당 5개의 종양을 배치합니다. 멸균 가위로 종양을 2-3mm 조각으로 자릅니다.
   1. 종양당 1mL의 dispase/collagenase D/DNase I 용액(1mL의 DMEMc 중 0.2 mg/0.2 mg/100 mg)으로 분해합니다. 습한 인큐베이터에서 37 °C, 5 % CO₂에서 배양하고 15 분마다 바늘없이 10mL 주사기와 3 회 혼합합니다.
2. 소화되지 않은 섬유를 제거하려면 100μm 필터를 통해 세포를 15mL 튜브에 맞춥니다(튜브당 필터당 웰 1개). PBS를 15mL에 넣고 460 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리 튜브를 넣고 상층액을 제거합니다.
3. 각 튜브에 1mL를 첨가하여 용해 완충액(NH₄Cl 150 mM, KHCO₃ 10 mM, EDTA 0.1 mM, pH 7.3, 20 °C)으로 적혈구를 용해합니다. 잘 섞고 모든 튜브의 용액을 하나로 결합하십시오. 2분 후 11mL의 얼음처럼 차가운(4°C) DMEMc로 반응을 중지합니다.
4. 460 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 펠릿을 15mL의 차가운 PBS로 재현탁합니다. 460 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다.
5. 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁합니다. 3μL의 Fc 블록 항체(CD16/CD32, 스톡 0.5mg/mL)를 추가하고 얼음에서 15분 동안 배양합니다.
6. 항체 추가: Ly6G-phycoerythrin 10μL(Ly6G-PE, stock 0.2mg/mL) 및 CD11b-allophycocyanin(CD11b-APC, stock 0.2mg/mL) 10μL. 20μL의 6-Diamidin-2-phenylindol 생존도 염료(DAPI, stock 5mg/mL)를 추가하고 어둠 속에서 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
   메모: 항체의 생존 염료와 형광 접합체의 또 다른 조합을 사용할 수 있습니다.
7. PBS를 최대 15mL까지 첨가하고 460 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.
8. DMEMc에서 펠릿을 약 10 x 10⁶/mL 농도로 재현탁시키고 얼음 위에 보관합니다.
9. 형광 활성화 세포 분류기를 사용하여 CD11b⁺ Ly6G^hi alive(DAPI 음성) 호중구를 정렬합니다(게이팅 전략, 그림 2 참조).
   메모: 정렬된 세포를 위해 세포 현탁액이 있는 튜브와 DMEMc가 있는 튜브를 4°C에서 유지합니다. 다음과 같은 최적의 분류 설정을 사용합니다: 70μm 노즐, 최대 22,000 이벤트/초의 임계값 속도 및 1-3의 유속
.
10. 권장 순도가 >95%인 세포분석기를 사용하여 분류된 호중구의 순도를 확인합니다.
11. 호중구를 460 x g, 4°C에서 5분 동안 분류한 원심분리기로 상층액을 제거합니다. DMEMc에서 분류된 세포를 1 x 10⁶/mL.
    의 농도로 재현탁합니다. 메모: 14일 B16F10 종양(직경 10mm) 1개에서 예상되는 호중구 수는 약 3 x 10⁴개 세포입니다.

4. 시험관 내 TAN의 NAMPT 억제

1. 100mM의 최종 농도에서 디메틸설폭사이드(DMSO)의 FK866(NAMPT 억제제) 스톡을 준비합니다.
2. 호중구를 종자 분류(단계 3.11)를 96웰 U-바닥 플레이트(1.5 x 10,⁵ 호중구/웰)의 2웰로 분류했습니다. FK866을 인터벤션 웰(최종 농도 100nM)에 추가하고 DMSO와 동일한 양의 DMEMc를 대조군 웰에 추가합니다. 습한 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO₂에서 2 시간 동안 배양합니다.
3. 460 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 각 웰에서 200μL의 PBS에 재현탁합니다. 2회 반복합니다.
4. 460 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 시판되는 내피 세포 성장 배지(4 μL/mL 내피 세포 성장 보조제, 0.1 ng/mL 재조합 인간 표피 성장 인자, 1 ng/mL 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자, 90 μg/mL 헤파린 및 1 μg/mL 하이드로코르티손 보충)에서 0.2 x 106 cells/mL(0.75 mL 내)의 최종 농도(5단계) 또는 PBS에서 0.6 x 10⁶ cells/mL의 최종 농도( 0.25mL 중).

결과

그림 1. 프로토콜의 체계입니다. 1 단계. B16F10 흑색종 세포주의 제조; 2. 쥐에 있는 동종 종양 모형; 3. 종양에서 TAN의 분리; 4. 시험관 내 TAN에서 NAMPT의 억제; 5. 대동맥 고리 분석실험에서 TAN의 혈관 형성 특성의 추정; 6. 동종 종양 모델에서 치료된 호중구의 입양 이식; 7. 종양 성장 모니터링, 조직학적 검사.

그림 2. TAN 정렬을 위한 게이팅 전략. CD11b⁺ Ly6G^hi al...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 ml 튜브	Sarstedt AG & Co., 뉘브레흐트, 독일	6,25,54,502
튜브 50ml	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, 프리켄하우젠, 독일	227261
5ml / 10ml / 25ml 자동 피펫용 멸균 팁	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, 프리켄하우젠, 독일	6006180 / 607180 / 760180
6웰 평평한 바닥 세포 배양 플레이트	Sarstedt AG & Co., 뉘브레흐트, 독일	8,33,920
96웰 평평한 바닥 세포 배양 플레이트	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, 프리켄하우젠, 독일	655180
96웰 U-바닥 세포 배양 플레이트	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, 프리켄하우젠, 독일	65018
안티 마우스 CD11b	BD 파미겐, 벡턴 디킨슨, 프랭클린 레이크스, 미국	553312	클론 M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL
안티 마우스 Ly6G	BioLegend(미국 캘리포니아)	127608	클론 1A8, PE 결합, 0.2mg/mL
BD FACS 아리아II	BD Biosciences, Becton Dickinson, 프랭클린 레이크, 미국		세포 분류기
캘리퍼스	Vogel Germany, Kevelaer, 독일
케이시 세포 계수기	Innovatis, Roche Innovatis AG, 빌레펠트, 독일
Cell Trics 50μm / 100μm 멸균 필터	Sysmex Partec GmbH, 독일 괴를리츠	04-004-2327 / 04-004-2328
원심분리기 Rotina 420 R	안드레아스 헤티히(Andreas Hettich), 독일 투틀링겐	4706
콜라겐분해효소 D	Sigma-Aldrich/Merck, 다름슈타트, 독일	11088858001
DAPI (4', 6-디아미디노-2-페닐인돌, 딜락테이트)	BioLegend(미국 캘리포니아)	422801	재고 : 5mg / ml
디스플레이 I	Sigma-Aldrich/Merck, 다름슈타트, 독일	D4818-2MG
DMEM을 참조하십시오.	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠)	제41966-029	DMEM 완료: DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신
DMSO(디메틸수폭사이드)	WAK-Chemie Medical GmbH, 슈타인바흐, 독일	왁-DMSO-10	크라이오슈어-DMSO
DNase I	Sigma-Aldrich/Merck, 다름슈타트, 독일	DN25-100MG
디피에스	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠)	제14190-094
내피 세포 성장 배지	PromoCell, 하이델베르크, 독일	C-22010
FBS (소태아 혈청)	Biochrom, 베를린, 독일	시즌 0115
Fc 블록(안티 마우스 CD16/32)	BD 파밍겐, 벡턴 디킨슨, 벡턴 디킨슨, 프랭클린 레이크, 미국	553142	클론 2.4G2, 재고 : 0.5mg/mL
FK 866 염산염	Axon Medchem, 흐로닝언, 네덜란드	축삭 1546	스톡: 100 mM
염소 안티-토끼 IgG H&L	Abcam, 영국 케임브리지	AB97075	Cy3-conjugated, 스톡: 0.5 mg/mL
Heracell 240i CO2 인큐베이터	Thermo Fisher Scientific(미국 월섬)	51026334
국제경영시스템(IMDM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠)	제12440-053	IMDM 완료: IMDM + 10% FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신
아이시스 GT420 면도기	B. Braun Asculap, Suhl, 독일	90200714
Matrigel Matrix 기저막	Corning Life Sciences, 네덜란드 암스테르담	7205011
단클론 안티 액틴, α 평활근	Sigma-Aldrich/Merck, 다름슈타트, 독일	F3777	FITC-conjugated, 재고 집중도에 대한 정보 없음
바늘 0.4 mm x 16 mm	BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, 미국	302200
네오마운트	Merck, 다름슈타트, 독일	HX67590916
노멀 염소 세럼	Jackson ImmunoResearch Laboratories, 미국 웨스트 그로브	TEL.005-000-121
페니실린 스트렙토마이신	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠)	15140-122
Pipetus 자동 피펫	Hirschmann Laborgeräte, 독일 에버슈타트	9907200
ProLong Gold Antifade Mountant(DAPI 포함	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠	P36935
토끼 안티 마우스 라미닌 감마 1 체인	Immundiagnostik, Bensheim, 독일	AP1001.1	재고 집중도에 대한 정보 없음
StemPro 아큐타아제	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠)	A1105-01
멸균 폐기 메스(15호)	MedWare(미국 네이플스)	120920
주사기 1ml	BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, 미국	303172
주사기 10ml	BD Discardit II, 벡턴 디킨슨, 프랭클린 레이크, 미국	309110
T75 멸균 세포 배양 플라스크	Sarstedt AG & Co., 뉘브레흐트, 독일	83,39,11,302

년 년 호 호 ) 호 년 ) 년