뇌종양 세포에 대한 면역요법 전략으로서의 Test β-Glucan을 분석하기 위한 분석

초록

출처: Folgado-Dorado, C. et al., 교모세포종에 대한 면역요법 전략으로서의 진균 β-글루칸의 분리 및 정제. J. Vis. 특급 (2023)

이 비디오는 β-글루칸을 사용하여 반응성 산소 종인 과산화물 라디칼 생성을 위해 미세아교세포를 활성화하는 체외 분석을 보여줍니다. 뇌암세포에서 생성된 반응성 산화물질은 종양세포 증식을 능동적으로 억제하고 세포의 사멸을 유도합니다.

프로토콜

β글루칸 유도 미세아교세포 자극에 대한 체외 연구

1. 8웰 챔버 슬라이드에서 마우스 교모세포종 및 미세아교세포 세포의 세포 배양

참고: 이 프로토콜은 GL261(교모세포종) 및 BV2(미세아교세포) 세포주에만 해당됩니다. 그러나 약간의 수정으로 이러한 단계는 잠재적으로 다른 암 및 면역 세포주를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

1. L-글루타민, 4.5g/L D-글루코스 및 피루브산 없이 변형된 Dulbecco의 변형된 DMEM(Modified Eagle's medium) 완전 배지를 준비합니다. 소 태아 혈청(FBS) 10%와 페니실린/스트렙토마이신 1%를 첨가합니다. 37°C의 수조에서 15분 동안 재료를 예열합니다.
2. 동결된 BV2 및 GL261 부분 표본을 수조(37°C)에 2분 동안 해동한 후 완전히 해동하기 직전에 층류 후드로 운반하고 세포를 두 개의 서로 다른 멸균 T25 플라스크(각 세포주당 하나씩)에 플레이트
화합니다.
3. 배양액이 합류할 때까지 37°C, 5% CO₂에서 T25 플라스크를 배양합니다.
   메모: 동결 조건과 냉동 보존 시간에 따라 합류까지의 시간이 달라질 수 있습니다. 이러한 세포주는 일반적으로 T75 플라스크에서 합류점에 도달하는 데 3-5일이 걸립니다.
4. BV2 세포 배양이 합류한 후 8웰 챔버 슬라이드 0.6 x 10⁶ cells/well로 이동합니다. 8웰 챔버 슬라이드를 인큐베이터에 24시간 동안 보관합니다.
5. 미세아교세포가 8웰 챔버 슬라이드에 플레이트화되면 GL261 세포에 대해 동일한 프로토콜을 반복합니다.

2. β-glucans를 이용한 microglia의 활성화

1. BV2 세포를 4개의 서로 다른 β-글루칸(P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum 및 H. erinaceus)으로 72시간 동안 0.2mg/mL 농도로 코팅합니다. 하나의 실험 조건은 치료되지 않은 상태(정상 배지)로 유지되어야 하며 대조군 역할을 해야 합니다.
2. 72시간 후 피펫으로 상층액을 수집하고 남은 부피를 0.20μm 주사기 필터에 통과시킵니다. 그런 다음 상등액을 -80°C에서 최소 24시간 동안 동결합니다.

3. 사전 활성화된 미세아교세포 조절 배지를 사용한 GL261 처리

1. GL261이 8웰 챔버 슬라이드 내에서 80% 합류하면 72시간 동안 25%의 최종 부피 농도에서 β-글루칸 처리된 미세아교세포 배지를 추가합니다(총 부피: 250μl/웰).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
8웰 챔버 슬라이드	써모 피셔, 미국	171080
둘베코의 변형된 독수리 배지, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼즈배드	10564011
확장 (α-아밀라아제/글루코 아밀라아제)	Novozymes, 덴마크
소 태아 세럼	Gibco, Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼즈배드	A4736301
인산염 완충 식염수	Gibco, Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼즈배드	제1010-015
페니실린/스트렙토마이신	시그마-알드리치, 세인트루이스	P4458
부 화기	에페도르프	갤럭시 170S

년 호