수지상 세포의 고염 처리 및 마우스로의 채택 전달 방법

초록

출처: Van Beusecum, JP, et al. 고염 처리 항원 제시 수지상 세포의 분리 및 입양 전달. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 고염 처리된 항원 제시 수지상 세포(DC)를 마우스로 입양하는 절차를 보여줍니다. 쥐 CD11c+ 수지상 세포(DC)는 다량의 나트륨을 함유한 배지에 노출되어 세포에서 이소레부글란딘(IsoLG)-단백질 부가물을 형성합니다. 이러한 부가물은 신생항원 역할을 하며 DC 표면에 표시됩니다. 고염 처리된 세포는 입양 세포 전달을 통해 마우스에 주입됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스에서 비장 분리

1. 1640 RPMI 준비(Roswell Park Memorial institute): 10% 소 태아 혈청(FBS), 0.10mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 1mM 피루브산 나트륨, 50μM β-메르캅토에탄올 및 1% 페니실린/스트렙토마이신.
2. 10-12주 된 C57bl/6 수컷 마우스를 CO₂ 흡입으로 안락사시킵니다. 마우스의 가슴과 옆구리에 70% 에탄올을 뿌립니다. 왼쪽에서 피부와 복강을 조심스럽게 열어 비장을 노출시킵니다.
3. 작은 집게를 사용하여 장과 간을 마우스의 왼쪽으로 조심스럽게 이동하고 가위를 사용하여 비장을 부드럽게 절제합니다.
   메모: 이 단계는 위장관의 손상으로 인해 오염이 유발될 수 있으므로 매우 신중하게 수행해야 합니다.
4. 절제된 각 비장을 3mL의 RPMI 1640 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.

2. 비장에서 단세포 현탁액 생성

참고: 비장은 기계적 해리와 효소 분해를 결합하여 단일 세포 현탁액으로 해리될 수 있습니다.

1. 준비된 RPMI 1640 배지에 콜라겐분해효소 D(1 mg/mL; 0.29 U/mg 동결건조) 및 DNase I(0.1 mg/mL)을 첨가하여 비장 분해 용액을 준비합니다(1.1단계 참조).
2. 겸자를 사용하여 비장 소화 용액 3mL가 들어 있는 C 튜브(해리 튜브)로 비장을 옮깁니다.
3. 제조업체의 지침에 따라 반자동 균질기를 사용하여 기계적 해리를 수행합니다.
   1. C 튜브를 반자동 균질기에 놓고 C 튜브가 회전 암에 단단히 고정되었는지 확인합니다. C 튜브가 배치되면 반자동 균질기의 시작 버튼을 눌러 60 s.
      동안 Spleen 04.01 프로토콜을 실행합니다. 참고: 50mL 원추형 튜브 위에 40μm 필터를 놓고 필터를 통해 비장을 부드럽게 분쇄하여 기계적 해리를 수행할 수도 있습니다. 비장을 분쇄한 후 40μm 필터를 10mL의 RPMI 매체로 헹굽니다.
4. 기계적 해리 후 균질기에서 튜브를 분리하고 효소 분해를 수행합니다. 연속 회전(20rpm)으로 37°C에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.
5. 40μm 스트레이너를 통해 여과한 후 50mL 원뿔형 튜브에 용액을 피펫팅하여 옮깁니다. 40μm 스트레이너를 10mL의 Dulbecco's PBS(dPBS)로 세척합니다. 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 셀을 원심분리합니다.
6. 원심분리 후 상층액을 완전히 흡인하고 10mL의 dPBS에 재현탁하여 펠릿을 세척합니다. 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기.

3. Splenic Single Cell Suspension에서 CD11c⁺ DC의 분리

1. 세포 펠릿을 5mL의 dPBS에 재현탁하고 혈구계 및 트리판 블루 배제를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
2. 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.
3. 상층액을 완전히 흡인하고 400μL의 자기 활성화 세포 분류(MAC) 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.
4. 1 x 10⁸ 세포당 100 μL의 CD11c 마이크로비드(재료 표 참조)를 추가합니다.
5. 세포 현탁액을 볼렉스하고 4°C의 냉장고에서 10분 동안 배양합니다.
6. 10mL의 MAC 버퍼를 추가하여 세포를 세척합니다. 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기.
7. 상층액을 완전히 흡입하고 500μL의 MAC 완충액에 재현탁합니다.

4. CD11c⁺ DC의 자기 분리

참고: 자기 분리는 LS 컬럼이 장착된 자기 분리기(재료 표 참조)를 사용하여 수동으로 수행됩니다. 자기 분리는 자동화된 자기 분리기를 사용하여 자동으로 수행할 수도 있습니다. (재료 표 참조).

1. LS 컬럼을 MAC 분리기의 자기장에 배치하고 각 컬럼 아래에 15mL 원추형 튜브를 배치하여 플로우 스루를 수집합니다.
2. LS 컬럼을 3mL의 버퍼로 헹굽니다.
3. 세포 현탁액을 각 LS 컬럼에 놓고 라벨링되지 않은 세포가 포함된 플로우스루(flow-through)를 수집합니다.
4. LS 컬럼을 3mL의 MAC 버퍼로 세척하여 통과한 라벨링되지 않은 세포를 수집합니다. LS 컬럼을 2회 더 세척합니다.
5. 자기 분리기에서 LS 컬럼을 제거합니다. 각 컬럼에 5mL의 MAC 버퍼를 추가하고 LS 컬럼을 깨끗한 15mL 코니컬 튜브에 단단히 밀어 넣어 자기 라벨링된 셀을 즉시 씻어냅니다.
   메모: 고순도 세포 현탁액을 얻기 위해 CD11c 세포의 이중 분리를 수행하는 것이 중요합니다. 따라서 3.1-4.5단계를 반복합니다. 순도 표준에 대해서는 그림 4를 참조하십시오. 이 단계는 CD11c⁺ 세포의 순도를 90–95%로 향상시킵니다.
6. 트리판 블루 배제를 사용하여 혈구계에서 CD11c⁺ DC 번호를 확인합니다. 세포 샘플을 0.4% 트리판 블루 용액에 1:1 희석하여 희석합니다.
   참고: 생존 불가능한 세포는 파란색으로 염색되고 생존 가능한 세포는 염색되지 않은 상태로 유지됩니다.
   1. 이를 위해 혈구계에 10μL의 세포 샘플 희석액을 조심스럽게 채우고 1분 동안 배양합니다.
   2. 실행 가능한 셀 수를 결정하기 위해 로드된 챔버에서 1 x 1 mm²의 4개 사각형에 있는 세포를 계산합니다.

5. CD11c⁺ DC의 시험관 내 고염 처리

1. 500mL 1640 RPMI에 10% FBS, 0.1mM HEPES, 1mM 피루브산 나트륨, 50μM β-메르캅토에탄올 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 DC 배양 배지를 준비합니다.
2. 1.17g의 NaCl의 무게를 측정하고 멸균 50mL 팔콘 튜브에 넣어 10x DC 고염 세포 배양 배지(400mM)를 준비합니다. 50mL의 멸균 DC 세포 배양 배지(5.1단계에서 준비)를 50mL 팔콘 튜브에 추가하고 NaCl이 용액에 포함될 때까지 와류를 만듭니다.
3. 세포 배양 후드에서 0.2μm 필터를 통해 진공 여과를 사용하여 고염도 DC 배양 배지를 즉시 여과합니다.
4. 비장의 각 세포 현탁액을 300 x g에서 4ºC에서 10분 동안 원심분리합니다.DC 배양 배지에 각 세포 펠렛을 1 x 10⁶ cells/mL의 농도로 재현탁합니다.
5. 24웰 평평한 바닥 Falcon 플레이트에 DC 현탁액의 900μL(약 1 x 10⁶셀)를 피펫으로 낳습니다. 100μL의 고염 DC 배양 배지를 각 웰에 추가하여 최종 나트륨 농도가 190mM가 되도록 합니다. 플레이트에 라벨을 붙이고 37°C 습도 CO₂ 인큐베이터에 48시간 동안 넣습니다.

6. 고염 처리된 CD11c⁺ DC의 입양 전달

1. 48시간 동안 체외 자극 후 37°C 부식 CO₂ 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다.
2. 세포 배양 배지를 위아래로 피펫팅하여 CD11c⁺ DC를 재현탁합니다.모든 CD11c⁺ DC 현탁액을 라벨이 부착된 해당 1.6mL 튜브에 피펫팅합니다. 플레이팅된 각 개별 웰에 대해 이 단계를 반복합니다.
3. 각 CD11c⁺ DC 현탁액을 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기합니다. 상층액을 흡입합니다. DC 펠릿을 100μL의 멸균 dPBS로 재현탁합니다.
4. 27G 1/2인치 바늘이 장착된 1mL 주사기에 DC 현탁액을 주입합니다.
5. 생후 10주 된 순진한 수컷 C57bl/6 마우스를 2% 이소플루란 아래에 두어 안정적인 수술 평면을 만듭니다. 페달 반사가 없는 상태에서 마취 수준을 확인하십시오. 안정적인 수술 평면이 달성되면 약 30°.
   의 각도로 바늘을 천천히 조심스럽게 후궤도 공간에 삽입합니다. 메모: 27G 바늘의 경사는 안구 손상을 방지하기 위해 눈에서 멀어지도록 아래를 향해야 합니다.
6. CD11c⁺ DC 현탁액(약 1 x 10,⁶셀)을 천천히 부드럽게 주입합니다. 주사가 완료되면 눈을 손상시키지 않도록 의식하면서 후안와 공간에서 바늘을 조심스럽게 제거합니다.
   메모: 주사 후에는 출혈이 거의 또는 전혀 없어야 합니다. CD11c⁺ DC의 채택 이식은 I.V. 주입 방법(예: 꼬리 정맥)을 사용하여 수행할 수도 있습니다. 대조군 마우스는 일반 염 배지에서 배양된 CD11c⁺ DC를 받았습니다.
7. 콧방울에서 마우스를 제거하고 마취에서 회복하는 동안 약 30분 동안 모니터링합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
APC/Cy7 안티 마우스 CD11c	바이오레전드	117324
autoMACS 실행 버퍼	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-091-221
CD11c 마이크로비즈 초순수	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-108-338
콜라겐분해효소 D	로슈	11088866001
DNase I	로슈	10104159001
칼슘과 마그네슘이 없는 dPBS	코 닝	21-031-이력서
FcR 차단 시약	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-092-575
FITC 안티 마우스 CD45	바이오레전드	103108
GentleMACS C 튜브	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-096-334
GentleMACS dissociator 장치	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-093-235	사용 프로토콜: 비장 04.01
LIVE/DEAD 고정성 바이올렛 데드 셀 스테인 키트	인비트로젠	L34964
LS 컬럼	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-401
QuadroMAC 분리기	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-090-976
RPMI 1640 배지	지브코	11835-030