$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. NIT-1 세포주의 엔지니어링 및 유지 보수
- 비만하지 않은 당뇨병(NOD) 마우스와 유전적 배경을 공유하는 NIT-1 세포주 및 5% CO2가 함유된 37°C 인큐베이터에서 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 4.5g/L 포도당을 함유하는 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM)의 조직 배양 처리 접시에서 293FT 세포를 유지합니다.
- transfection을 위해 293FT 세포를 70%-80% confluence로 성장시킵니다.
- 293FT 세포의 10cm 접시당 구성적으로 활성화된 EF1α 전구체의 제어 하에 반딧불이 루시페라제 전이유전자(luc2)를 발현하는 pLenti-luciferase-blast 10μg, 패키징 플라스미드 pMD2.G, pMDLg/pRRE 및 pRSV-Rev 각 2μg, 외피 단백질 플라스미드 pCMV-VSV-G 4μg을 결합하고, 및 60 μg의 선형 폴리에틸렌이민(PEI)이 1 mL의 무혈청 DMEM에 함유되어 있습니다. transfection할 세포의 수에 따라 양을 조정합니다.
- DNA, PEI 및 DMEM을 실온(RT)에서 20분 동안 그대로 두었다가 293FT cell에 추가합니다.
- transfection 48시간 후에 렌티바이러스 입자를 함유한 배지를 수집합니다.
- 48-72시간 동안 106 세포당 렌티바이러스 입자를 포함하는 1mL의 배지로 ~80% 포화도에서 NIT-1 세포를 형질도입합니다.
- 48시간 동안 5 μg/mL blasticidin으로 루시페라아제 발현 세포를 선택합니다.
- 또한, 실험 질문에 맞게 루시페라아제 발현 세포를 유전적으로 변형합니다. 비교를 위해 루시퍼라아제 발현 야생형 또는 비표적화 대조군 세포주를 포함합니다.
메모: 표적 유전자 변형의 예로는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) knockout, CRISPRa/i, shRNA knockdown 및 overexpression이 있습니다.
2. 이식을 위한 NIT-1 세포의 준비
- 루시퍼라아제 발현 세포가 80%-90% 융합될 때까지 성장시킵니다.
- 성장 배지를 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS, 10cm 접시의 경우 5mL)로 세포를 세척합니다.
- 0.05% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(트립신-EDTA) 1mL를 각 접시에 2분 동안 추가합니다.
- 5mL의 성장 배지로 트립신을 중화합니다.
- 피펫을 사용하여 접시에서 세포를 씻어내고 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
메모: 동일한 세포주의 여러 접시에서 추출한 세포를 결합할 수 있습니다.
- 트리판 블루(trypan blue)와 같은 염색을 사용하여 혈구계를 사용하여 수동으로 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 자동으로 세포를 계수합니다.
- 250 × g에서 상온에서 5분 동안 원심분리기를 하고 흡입 피펫으로 상층액을 제거합니다.
- 세포 펠렛을 PBS에 5 × 107 cells/mL의 농도로 재현탁합니다(마우스당 세포주당 107 세포는 200 μL의 부피로 이식됨).
- 이식할 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오(최대 3시간 동안).
3. 비만하지 않은 당뇨병-중증 복합 면역결핍증(NOD-scid) 마우스에 NIT-1 세포 이식
- 수혜 마우스(비장 세포를 분리하는 데 사용된 마우스와 동일한 성별의 8-10주 된 NOD-scid 마우스)를 녹다운 챔버에서 이소플루란 흡입으로 마취합니다. 1.5L/min의 유속과 9L/min의 배출 속도로 2.5% 이소플루란을 챔버로 전달합니다.
- 건조를 방지하기 위해 동물의 눈을 안과 연고로 윤활하십시오.
- 가드가 있는 전기 면도기를 사용하여 생쥐의 뒤쪽(등쪽)에서 털을 제거하여 피부를 노출시킵니다. 면도 이식 면적은 약 1인치 x 2인치입니다. 이식이 이루어질 때까지 면도한 마우스를 녹다운 챔버로 되돌립니다.
- 마우스를 한 번에 하나씩 이소플루란 노즈 콘이 있는 깨끗한 표면으로 옮깁니다. 마우스의 머리를 노즈콘 안으로 부드럽게 안내합니다. 이식 중 마취를 유지하기 위해 0.25L/min의 이소플루란 유속을 사용하십시오.
- 이소프로필 알코올 준비 패드로 이식 부위를 닦아 느슨한 털을 제거하고 피부를 소독합니다.
- 주사기를 로드하기 전에 세포가 완전히 재현탁되었는지 확인하십시오. 26G 바늘을 사용하여 1mL 멸균 주사기에 초과량(>300μL)의 세포를 추출합니다. 거품을 제거하십시오. 그런 다음 300μL의 세포 현탁액이 주사기에 남아 있도록 여분의 세포를 튜브로 되돌립니다.
- 주로 사용하지 않는 손에 잡은 한 쌍의 구부러진 집게를 사용하여 마우스 등의 한쪽(왼쪽 또는 오른쪽)에 있는 피부를 부드럽게 들어 올려 피하 공간에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.
- 주로 사용하는 손을 사용하여 주사기를 마우스 몸체의 관상면 및 시상면과 평행하게 배치합니다. 바늘이 마우스의 머리를 향하게 하여 바늘을 뒷다리 근처의 피부에 삽입하고 부드럽게 피하 공간으로 안내합니다. 바늘 전체가 피부 아래에 남아 있고 찌르지 않는지 확인하십시오.
- 집게를 조정하여 바늘 바닥 주위의 피부를 부드럽게 잡습니다. 소량의 세포 현탁액(<50μL)을 천천히 분주하고 주입 부위의 피부 아래에 작은 돌출부가 형성되는지 확인합니다. 200μL가 피하 공간으로 전달될 때까지 세포 현탁액을 계속 주입합니다.
- 집게를 제자리에 잡고 바늘을 마우스의 몸체와 평행하게 유지하면서 바늘을 천천히 빼냅니다. 바늘을 제거한 후 찔린 상처에서 세포가 새어 나오지 않도록 몇 초 동안 집게로 피부를 닫으십시오.
- 유전자 변형을 평가하는 경우, 다른 주사기를 사용하여 마우스의 반대쪽에 이식을 반복하여 돌연변이 세포와 대조 세포가 모두 왼쪽에, 다른 세포주가 오른쪽에 있도록 각 마우스에 주입합니다. 하나의 세포주만 이식하는 경우 한쪽 면에만 세포를 주입합니다.
- 이식 후 각 마우스를 새 케이지로 옮깁니다. 케이지에 마우스를 추가하기 전에 각 마우스가 마취에서 완전히 회복될 때까지 기다립니다.
메모: 생쥐는 정상적인 활동을 재개하고 무기력증이나 운동 장애의 징후를 보이지 않을 때 회복됩니다.
- 이식 후 실험 기간 동안 매일 마우스의 건강 상태를 평가합니다. 이식편이 크게 부풀어 오르거나 마우스가 약해지고 무기력해지면 혈당을 측정하고 모든 저혈당 마우스에게 10%(w/w)의 자당 물을 자유자재로 제공합니다. 모든 수의학적 권장 사항을 따르고 기관 지침에 따라 신체 상태가 계속 좋지 않은 마우스는 안락사시킵니다. 이 연구에서 쥐는 CO2 흡입 후 자궁 경부 탈구로 안락사되었습니다.
4. 자가반응성 비장세포의 분리 및 정제
- 소변(또는 혈액) 포도당 검사지를 사용하여 최근(10일 미만) 당뇨병이 있는 10-16주 된 수컷 또는 암컷 NOD 마우스를 식별합니다. NOD 마우스는 최소 2일 연속으로 소변/혈당 ≥250mg/dL이 있을 때 당뇨병이 있는 것으로 간주됩니다.
메모: NOD-scid 마우스 한 마리당 1,000만 개의 비장 세포가 필요합니다. 하나의 비장은 일반적으로 5천만 개에서 1억 5천만 개의 비장 세포를 산출합니다.비장 세포는 sentinal 모니터링 시설에 수용된 병원체가 없는 마우스에서 분리되었습니다.
- 적절한 수의 당뇨병성 NOD 마우스를 안락사시킵니다.
메모: 이 연구에서 쥐는 CO2 흡입 후 자궁 경부 탈구로 안락사시켜 죽음을 보장했습니다.
- 마우스를 등에 대고 수술용 가위로 피부를 약 2인치 길이로 세로로 절개합니다. 연구자의 관점에서 마우스의 오른쪽을 열고 밝은 빨간색 비장을 찾습니다. 분홍색 췌장에서 비장을 부드럽게 잘라내고 5mL의 멸균 PBS가 들어 있는 10cm 페트리 접시에 옮깁니다. 필요한 만큼의 마우스로 해부를 반복합니다.
메모: 여러 쥐의 비장을 한 접시에 결합할 수 있습니다. 멸균 후드에 있는 멸균 시약과 장비를 사용하여 다음 단계를 수행합니다.
- 멸균 주사기 플런저의 평평한 상단으로 비장을 으깨십시오.
- 40 μm 또는 70 μm 스트레이너를 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 5 mL의 PBS로 스트레이너를 세척하여 프라이밍합니다. 비장 현탁액을 스트레이너로 옮기고 스트레이너를 통해 부드럽게 매싱을 계속합니다. PBS 10mL로 접시를 씻고 세척물을 여과기로 옮깁니다. 스트레이너에서 붉은 색이 사라질 때까지 계속 매싱하십시오.
- 스트레이너를 버리고 RT에서 5분 동안 500×g으로 튜브 를 돌립니다. 흡인 피펫으로 상층액을 제거합니다.
- RT로 예열된 ACK 용해 완충액 5mL(최대 3개의 비장용)에 세포 펠릿을 재현탁하고 적혈구를 4분 동안 용해합니다.추가 비장이 필요한 경우 비장당 부피를 1-2mL 늘립니다.
- 5mL의 lysis buffer당 5mL의 NIT-1 cell media(위에서 설명)로 반응을 중지합니다. 세포 현탁액을 새 여과기에 통과시켜 덩어리를 제거합니다. 스트레이너를 버리고 상온에서 5분 동안 500×g으로 회전합니다.
- 세포 펠릿을 PBS 20mL에 재현탁하고 세포 계수. RT에서 5분 동안 500 × g으로 회전합니다. 1.5 mL safe-lock 반응 튜브에서 1 × 108 cells/mL(주입 부피는 0.1 mL/mouse)의 농도로 sterile PBS에 세포를 재현탁합니다.
- 세포를 얼음 위에 보관하거나(1시간 이하) 세포를 RT로 유지하고 즉시 꼬리 정맥 주입을 진행합니다.
5. 외측 꼬리 정맥을 통한 당뇨병성 비장 세포의 정맥 주사
- 성체 수혜자 NOD-scid 마우스의 몸을 워밍업(예: ~5-10분 동안 열 램프 사용)하여 정맥을 혈관 확장시킵니다(시각화 및 정맥 주입에 도움이 됨).
메모: 마우스의 과열을 방지하려면 이 시간을 초과하지 마십시오. 항상 상태를 모니터링합니다. 쥐가 지치거나 움직이지 않는 것처럼 보이면 열 램프를 즉시 끄십시오.
- 세포 현탁액을 예열합니다. 멸균 바늘(27-30G, 0.3mm/0.5인치 이하)이 있는 멸균 주사기(0.3-1.0mL)를 준비하거나 0.3mm(0.5인치) 바늘이 있는 멸균 0.5mL 인슐린 주사기를 사용합니다. 항상 바늘을 멸균 상태로 유지하고 주사 사이에 주사기를 내려놓아야 하는 경우 멸균 트레이를 사용하십시오.
- 각 주입 전에 비장 세포 용액을 재현탁하십시오. 각 마우스에 대해 예열 및 혼합된 비장 세포 현탁액 100μL를 주사기에 주입합니다. 주사기 또는 서스펜션에 기포가 없는지 확인하십시오.
메모: 마우스를 구속 장치에 넣기 전에 모든 장비와 용품(소독을 위한 알코올 물티슈, 주입할 비장 세포가 들어 있는 주사기, 주입된 마우스를 분리하기 위한 새 케이지)을 준비했는지 확인하십시오.
- 마우스를 구속 장치에 놓습니다. 주로 사용하지 않는 손으로 꼬리를 잡고 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나를 찾습니다. 필요한 경우 꼬리를 부드럽게 돌립니다. 소독 물티슈(70% 이소프로필 알코올)로 꼬리를 닦아 피부를 청소하고 정맥의 가시성을 높입니다.
- 주로 사용하는 손으로 꼬리의 중앙 부분에 예각으로 바늘을 삽입합니다. 바늘의 경사가 위를 향하게 하여 바늘을 피부를 통해 몇 밀리미터 밀어 넣습니다.
메모: 바늘이 정맥과 평행하고 피부 약간 아래에 위치하는지 확인하십시오. 피부/혈관 벽을 관통한 직후 마우스/꼬리의 갑작스러운 움직임에 대비하십시오. 바늘을 성공적으로 삽입하면 정맥 속으로 "부드럽게 미끄러지는" 것처럼 느껴져야 합니다. 다른 시도가 필요한 경우 꼬리를 몸통 쪽으로 더 위로 이동합니다.
- 주사기에 부드러운 압력을 가하여 비장 세포 현탁액을 주입합니다. 주입할 때 바늘이 더 안쪽이나 바깥쪽으로 움직이지 않도록 하십시오. 성공적인 주사는 주사 중 배압을 느끼지 않고 매끄럽게 진행되며 주사 직후 투명/백색 혈류로 표시됩니다.
- 정맥에서 바늘을 부드럽게 풀고 출혈이 멈출 때까지 소독 물티슈로 꼬리에 가벼운 압력을 가합니다. 구속 장치에서 마우스를 풀고 새로 준비된 케이지로 부드럽게 옮깁니다.
메모: NIT-1 세포 이식을 받지 않은 2-3개의 대조군 마우스에 비장세포를 주입하여 주사 후 약 2-4주가 소요되는 당뇨병을 유발하는 자가반응성 비장세포의 가능성을 확인합니다.
6. NIT-1 이식편의 생체 내 생물 발광 이미징
참고: 일주일에 1-2회 이식편을 이미지화합니다. 이식 당일에는 이식편이 정착하고 안정적인 루시페라아제 발현을 보장할 수 있도록 이식 후 최소 2시간을 기다립니다. 시간이 제한 요소인 경우 대신 1일차에 초기 측정을 수행할 수 있습니다. 권장되는 초기 이미징 일정은 주사 후 0일 또는 1일, 5일, 10일, 14일, 18일 및 25일입니다. 그러나 생체 발광 신호의 손실로 판단되는 자가면역의 진행 상황에 따라 일정을 조정합니다.
- Dulbecco의 PBS에서 15mg/mL D-루시페린 용액을 준비합니다. RT에서 교반하여 용해시키고 멸균 필터(0.22μm)를 멸균합니다. 1mL 부분 표본을 -20°C에서 보관하고 필요에 따라 해동합니다.
메모: 부분 표본은 다시 동결할 수 있습니다.
- 이미징 최소 5분 전에 1mL 주사기와 26G 바늘을 사용하여 150mg/kg의 용량으로 D-루시페린 용액을 사용하여 마우스에 복강내 주입합니다.
메모: 각 마우스에 새 주사기와 바늘을 사용하십시오.
- 기관 지침에 따라 이소플루란 흡입으로 마우스를 마취합니다. 권장 조건은 2.5% 이소플루란이며, 1.5L/min의 유속이 녹다운 챔버로 유입되고 9L/min의 배출 속도가 됩니다.
- 건조를 방지하기 위해 동물의 눈을 안과 연고로 윤활하십시오.
- 이미징 기기와 연결된 소프트웨어를 엽니다. 새 사용자 및/또는 로그인을 만듭니다. 오른쪽 하단의 제어판에서 초기화를 선택합니다(그림 1A). 이미징 데이터를 자동으로 저장하려면 컴퓨터에 적절한 폴더를 만든 다음 Acquisition(획득) | 자동 저장... (그림 1A). 기기 초기화가 완료되면 노출 시간을 1분
로 설정합니다.
메모: 전체 이미징 매개변수는 그림 1B에 나와 있습니다.
- 마우스를 한 번에 하나씩 knockdown chamber에서 이미징 기기로 옮깁니다. 팔다리를 벌리고 쥐를 엎드려 눕히고 머리를 콧방울 안으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 콧방울을 통해 전달되는 0.25L/min의 이소플루란 유속은 이미징 중 마취를 유지하는 데 적합합니다. 양손으로 마우스의 뒤쪽 중앙을 누른 다음 손을 바깥쪽으로 벌려 마우스를 부드럽게 평평하게 만듭니다.
- Acquire를 선택합니다(그림 1B). 팝업 창에 실험의 관련 세부 정보를 기록합니다(그림 1C).
메모: 다양한 시점에서 두 개의 이식편을 이식한 8주 된 암컷 NOD-scid 마우스 3마리의 대표 이미지는 그림 2A를 참조하십시오.
