마우스 모델에서 약독화 포자조산을 이용한 피내 면역

초록

출처: Mac-Daniel, L., et al. 생쥐 피부에서 골수성 세포 분리 및 생약독 Plasmodium Sporozoites를 사용한 피내 면역 후 림프절 배출. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 생쥐 모델에 살아있는 약독화 포자형성물을 면역시키기 위한 분석을 보여줍니다. 방사선 감쇠된 Plasmodium sporozoites는 쥐 귀의 등쪽에 주입됩니다. 양쪽 귀의 여러 위치에 주사를 맞은 후 마우스가 회복할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 재료 및 시약

1. 앞에서 설명한 대로 감염된 쥐의 출현 후 3-5일 후에 먹이를 먹고 후방되는 암컷 Anopheles stephensi 모기(Sda500 균주)를 사용합니다.
2. 구성적 Heat Shock Protein 70 (HSP70) 프로모터의 제어하에 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 발현하는 기생충 Plasmodium berghei ANKA 클론을 사용합니다. 이것은 기생충의 수명 주기 전반에 걸쳐 밝은 형광을 생성합니다.
3. 암컷 C57BL/6JRj 마우스(7주령)를 사용합니다.
   메모: 설명된 프로토콜에 사용된 모든 시약은재료/장비의 T에 나열되어 있습니다.

2. 모기 타액선에서 방사선 감쇠 포자광

분리

1. 감염성 혈액 식사 후 18-25일 사이에 앞에서 설명한 대로 얼음 위의 15ml 튜브에 모기를 모아 냉 마취합니다. 튜브를 뒤집어 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 곤충을 얼음 위에 유지하고 모기를 12 크라드의 γ 또는 x 방사선에 노출시킵니다.
2. 앞서 설명한 바와 같이 방사선 조사된 모기 타액선에서 약독화된 포자암을 분리합니다. 감염된 타액선을 얼음 위에 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)를 소량(약 15μl)으로 모으고 부드럽게 분쇄하여 포자물을 방출합니다.
   메모: 소량에 고농축 기생충 현탁액을 주입하는 것이 중요하므로 녹색 형광의 강력한 발현으로 입증된 바와 같이 미리 선택된 잘 감염된 많은 수의 모기에서 충분한 수의 타액선을 채취하는 것이 필수적입니다.
3. 덩어리와 모기 파편을 제거하기 위해 낮은 접착력 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 맞게 조정된 35μm 세포 여과기 캡을 통해 스포로조이트 현탁
액을 여과합니다.
4. 앞서 설명한 대로 분리된 포자충 암의 총 수를 세고 차가운 1x DPBS로 기생충 현탁액의 농도를 조정하여 83,000 포자충/μl를 얻습니다. 다음 단계를 계속하면서 기생충을 얼음 위에 보관합니다.
5. 음성 대조군으로 사용될 감염되지 않은 모기로부터 동일한 수의 타액선을 수집하고 2.2 및 2.3 단계에서 설명한 대로 샘플을 처리합니다. 위에 표시된 대로 샘플을 희석하여 현탁액에서 유사한 농도의 타액선 추출물을 얻습니다.
   메모: 스포로조이트는 얼음 위에 최대 2시간 동안 보관할 수 있습니다. 그러나 이상적으로는 침샘을 분쇄한 후 한 시간 이내에 주사하는 것이 좋습니다.

3. 귀의 진피층에 포자대를 주입

합니다.

1. 케타민(50mg/kg)/자일라진(5mg/kg) 혼합물의 복강내 주사로 동물을 마취합니다. 마우스가 의식을 잃을 때까지 5-8분 정도 기다렸다가 눈에 안과 연고를 발라 각막 건조를 방지합니다. 양쪽 뒷발에 부드러운 발가락 꼬집기를 수행하여 마취 깊이를 평가합니다.
   메모: 마취 시간은 20분 미만이므로 다음 단계를 신속하게 수행해야 합니다.
2. 미리 실체 현미경 아래에 놓인 투명 테이프로 복부 쪽을 고정하여 마우스의 귓바퀴를 고정합니다(그림 1A). 혈관 구조가 손상되지 않도록 귀를 부드럽게 누르십시오.
3. 10μl 주사기/35게이지 베벨 바늘에 0.6μl의 재현탁된 기생충을 로드합니다.
4. 혈관이 생기지 않도록 주의하면서 귀의 등쪽(그림 1A), 표피 아래, 베벨을 위로 향하게 하여 바늘을 조심스럽게 삽입하여 4개의 주입 부위(부위당 0.15μl)에 스포로조이트 현탁액을 전달합니다. 주사제를 제거하기 전에 주사제의 역류를 방지하기 위해 바늘을 몇 초 동안 진피에 그대로 두십시오. 절차가 끝날 때 각 주입 부위에서 특징적인 구진을 관찰합니다(그림 1B 및 1C).
5. 주사 후 테이프에서 귀를 조심스럽게 제거합니다.
6. 3.2-3.4 단계에 따라 반대쪽 귀에 동일한 용량의 기생충을 주입합니다.
2마리의
7. 마우스에 0.6μl의 1x DPBS 또는 0.6μl의 1x DPBS + 타액선 추출물을 추가로 주입하여 주사 단독으로 매개되는 염증 반응과 진피에 모기 물질의 침착을 평가합니다.
8. 마우스가 케이지에 다시 넣기 전에 마취 후 회복을 모니터링합니다.
   메모: 피부의 적절한 포자자 증착은 형광 현미경(그림 2A 및 2B)으로 모니터링할 수 있으며, 마우스는 앞서 설명한 대로 준비됩니다.

결과

그림 1 : Intradermal Sporozoites를 마우스의 귀에 주입합니다. (A) 마취된 마우스의 귓바퀴에 포자포자를 피내 주입하는 이미지. 귀의 복부 쪽은 이전에 해부 현미경 아래에 놓인 투명 테이프로 안정화되어 있습니다. 바늘은 경사가 위로 향하게 하여 귀의 등쪽 표피 아래에 조심스럽게 삽입합니다. (BC) 0.1-0.2 μl의 기생충 현탁액의 피내 주사 전(B)과 후(C) 귓바퀴의 등쪽 쪽을 보여주는 사진. 특징적인 구진(검은색 화살표)은 수술 종료 시 주입 부위에서 관찰할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케타민 : Imalgene® 1000	메리알	-	-
자일라진: 롬푼® 2%	바이엘	-	-
NanoFil 주사기 + 35 게이지 바늘	세계적인 정밀 기기	-	-
Omnican® 50 인슐린 주사기 0,5ml/50 I.U.	B. 브라운 메디컬	9151125	-
MultiwellTM 6웰 조직 배양 플레이트 – 평평한 바닥	BD 팔콘	353046	-
70 μm 세포 스트레이너	BD 팔콘	352350	-
주사기 2ml	테루모	친위대-02S	-
BLUE MAXTM 15ml 폴리프로필렌 원추형 튜브	BD 팔콘	352097	-
BLUE MAXTM 50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브	BD 팔콘	352098	-
5ml 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브(35μm 셀 스트레이너 캡 포함	BD 팔콘	352235	-
DPBS 1X Cacl2- 및 MgCl2-free	생명 기술	제14190-094	-
DMEM 1X + 글루타맥TM	생명 기술	31966-021	-
소 췌장에서 추출한 디옥시리보뉴클레아제 I, IV형	시그마-알드리치	D5025	50 μg/ml
암컷 C57BL/6JRj 마우스(7주령)	잔비에 연구소	-	-

) 호 년