1. 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서 인간 iPSC(hiPSC) 배양
참고: hiPSC를 배양하기 위한 대체 방법도 사용할 수 있으며, 여기에는 젤라틴, 젤라틴 단백질 혼합물, 재조합 라미닌 511 또는 hiPSC 확장에 사용되는 기타 세포 외 기질로 사전 코팅된 6웰 플레이트에 파종하는 것이 포함되나 이에 국한되지 않으며, 인간 만능 줄기 세포 배양을 위해 특별히 제조된 정의된 배지를 사용하여 배양할
수 있습니다.
- MEF 배양
- 10cm 세포 배양 페트리 접시에 0.1% 젤라틴 4mL를 코팅하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 조사된 MEF 4 x 106 바이알을 37°C MEF 배지 10mL(Dulbecco's Modified Eagle Medium[DMEM] + 10% 소 태아 혈청(FBS) + 1x 페니실린-스트렙토마이신 + 1x L-글루타민 보충제)에 빠르게 해동합니다. 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 흡인하고 세포 펠렛을 9mL의 MEF 배지에 재현탁합니다.
- 인큐베이터에서 젤라틴으로 코팅된 접시를 꺼냅니다. 젤라틴을 흡입하고 7mL의 MEF 매체를 추가합니다. MEF 현탁액 3mL(1.1.2단계부터)를 젤라틴이 코팅된 접시에 플레이트로 가열합니다. 접시를 좌우로, 앞에서 뒤로 흔들어 접시에 MEF가 고르게 분포되도록 합니다. 37 ° C에서 8-36 시간 동안 배양하십시오.
- MEF
에서 hiPSC 패스에이징
참고: 이 데이터는 장기 배양된 흑색종 종양 침윤 림프구(TIL)에서 유래한 T 세포 1(MART-1) iPSC에 의해 인식되는 흑색종 항원을 사용하여 생성되었으며, 이는 인간 백혈구 항원(HLA)-A*02:01의 맥락에서 MART-1 펩타이드를 특이적으로 인식합니다.
- 통로 hiPSC는 군체의 직경이 0.8 - 1.2mm 사이일 때 발생합니다. 계대 배양 전에 실체 현미경에서 hiPSC 콜로니를 확인하고 200 μL 팁의 플라스틱 가장자리를 사용하여 배양물에서 분화되는 모든 영역을 제거합니다.
- 사용한 배지를 흡인하고 10μM Rho 관련 단백질 키나아제(ROCK) 억제제가 보충된 10mL hiPSC 배지(인간 배아 줄기세포[ES] 배양 배지[Table of Materials] + 10ng/mL 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자[hbFGF])를 추가합니다.
- 세포 배양 접시를 한 손으로 잡고 일회용 세포 통과 도구를 접시 전체에 걸쳐 한 방향으로 굴립니다. 롤러 블레이드 전체가 배양 접시에 닿고 압연 동작 중에 균일한 압력을 유지하도록 충분한 압력을 가합니다.
- 배양 접시를 90°로 회전하고 1.2.3단계를 반복합니다. 현미경으로 플레이트를 보고 체크 무늬로 보여야 하는 군체의 적절한 절단을 육안으로 확인합니다. 200 μL 피펫을 사용하여 부드럽게 기계적으로 세척하여 절단된 콜로니를 분리합니다.
메모: 기계적 플러싱에 의한 절단된 콜로니의 분리는 롤러로 콜로니를 절단한 직후에 수행해야 하는데, 3분 후에 절단된 콜로니가 접시에 다시 부착되기 시작하고 플러싱으로 균일한 크기의 콜로니를 분리하기 어려워지기 때문입니다.
- 350 - 600 덩어리의 절단된 콜로니를 10 μM ROCK 억제제가 보충된 10 mL의 새로운 hiPSC 배지와 함께 새로운 10 cm MEF 접시(hiPSC 계승 8 - 36시간 전에 도금)로 옮깁니다. 37 °C에서 배양하십시오 .
참고: 600개의 덩어리는 약 1.0 x 106 MART-1 iPSC를 나타내며 35일째에 0.5-1.0 x 106 DP 세포를 생성합니다. 그러나 예상 수치는 시작 세포주의 효능과 배양 조건에 따라 달라집니다.
- 다음 날, 사용한 배지를 흡인하고 새로운 hiPSC 배지 10mL를 추가합니다. hiPSC 성장률에 따라 1-2일마다 hiPSC 배지를 교체하십시오.
2. hiPSC와의 공동 배양을 위한 OP9/DLL1 세포 준비
- 37°C에서 OP9 배지[α-minimum essential medium (α-MEM) + 20% 소 태아 혈청(FBS) + 1x 페니실린-스트렙토마이신]에서 OP9/DLL1 세포를 배양합니다. OP9/DLL1 세포가 포화도에 도달하면 배지를 흡인하고 5mL의 1x 마그네슘, 칼슘 및 페놀 무적색 인산염 완충 식염수(PBS)로 한 번 세척합니다.
- PBS를 흡인하고 0.05% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 2mL를 추가합니다. 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 4mL의 OP9 배지를 추가하고 피펫팅으로 세포층을 기계적으로 해리하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다.
- 세포 뭉침을 방지하기 위해 100μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기. 상등액을 흡인하고 12mL의 OP9 배지에 재현탁합니다.
- 8mL의 OP9 배지를 6개의 새로운 10cm 세포 배양 페트리 접시에 추가합니다. 2.3단계의 OP9/DLL1 세포 현탁액 2mL를 각각의 새로운 10cm 접시에 플레이트화합니다. 접시를 좌우로 흔든 다음 앞에서 뒤로 흔들어 접시 위에 OP9/DLL1이 고르게 분포되도록 합니다.
- 37 °C에서 배양합니다. 세포가 포화도에 도달하면 2 - 3 일마다 통과 방법을 반복합니다 .
메모: OP9/DLL1 세포의 동결 재고를 충분히 만들고 4-6주마다 새로운 재고를 해동하는 것이 중요합니다.
3. hiPSC를 CD8αβ+ Single Positive(SP) T 세포로 체외 분화
- hiPSC와 공동 배양하기 일주일 전에 젤라틴화된 OP9/DLL1 요리를 준비합니다. 0.1% 젤라틴 용액을 준비하려면 PBS 500mL에 실온(RT) 조직 등급 스톡 젤라틴 용액 5mL를 추가합니다.
- 접시당 0.1% 젤라틴 4mL를 추가하여 새로운 10cm 세포 배양 페트리 접시 3개를 코팅합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양합니다.
- 젤라틴을 흡입하고 각 접시에 8mL의 OP9 배지를 추가합니다. OP9/DLL1의 합류 접시 1개(위의 섹션 2에서 수행한 것처럼)를 젤라틴이 미리 코팅된 접시 3개에 통과시킵니다.
- 4일 후, 젤라틴에 OP9/DLL1 10cm 접시에 OP9/DLL1 접시 10mL를 접시당 20mL 배지로 추가합니다.
- 7 - 8일 후, OP9/DLL1 융합 접시에서 hiPSC 공동 배양을 시작합니다(분화 0일차).
- MEF에 대한 hiPSC의 합류 10cm 접시에서 사용한 배지를 흡인합니다. OP9 배지 10mL를 추가합니다. 1.2.3 및 1.2.4단계에서와 같이 일회용 세포 보태 도구를 사용하여 hiPSC 집락을 절단하고 분리합니다.
- 200 μL 피펫을 사용하여 10 mL의 새로운 OP9 배지와 함께 350 - 600 개의 절단된 콜로니 덩어리를 10cm 사전 젤라틴화된 OP9/DLL1 접시(3.1단계)로 옮깁니다. 배양 접시를 좌우로, 그리고 앞에서 뒤로 흔들어 군체의 균등한 분포를 보장합니다.
메모: 대안적으로, 사전 형성된 hiPSC 배아체(EB) 또는 작은 덩어리 현탁액을 사용할 수 있습니다. 그러나 균일한 크기의 hiPSC 덩어리를 생성하기 위해서는 일회용 세포 계대 배양 도구 또는 EB 형성 시스템을 사용하는 것이 좋습니다.
- 1일차에 사용한 배지를 흡인하고 20mL의 새로운 OP9 배지로 교체합니다. OP9/DLL1에서 1일 동안 공동 배양된 hiPSC 덩어리는 작은 원형 단층 콜로니로 나타납니다(그림 1).
- 5일차에 사용한 배지 10mL를 흡인하고 새로운 OP9 배지 10mL를 추가합니다. hiPSC 집락은 다층의 어두운 중심을 특징으로 하는 원시 중배엽으로 분화하기 시작합니다.
- 9일차에 사용한 배지 10mL를 흡인하고 새로운 OP9 배지 10mL를 추가합니다. 이 시점에서 다층의 중심 구조는 돔과 같은 모양으로 진화하고 주변 네트워크와 같은 영역이 분명해집니다.
- 13일째에 조혈전구세포(HPC)를 채취합니다(그림 1).13일째의 hiPSC 유래 구조는 인간 배아 줄기세포 유래 조혈전구세포를 둘러싸고 있다고 이전에 보고된 조혈대(hematopoietic zone, HZ)를 대표하는 돔 모양의 영역 네트워크로 둘러싸인 어두운 중앙 오가노이드를 특징으로 합니다.
참고: 돔과 같은 구조의 존재는 어두운 중심이 없는 경우에도 성공적인 과정을 나타냅니다. HPC를 생산할 수 없는 이유는 OP9/DLL1의 낮은 품질, FBS 로트의 품질, OP9/DLL1에 파종된 iPSC 덩어리의 융합도(350-600 덩어리가 최적) 및/또는 조혈 전구체를 생산하기 위한 iPSC 라인의 효능 변화 때문일 수 있습니다.
- 사용한 배지를 흡입하고 칼슘과 마그네슘(HBSS)으로 변형된 1x 페놀 레드 프리 행크스 밸런스드 솔트 용액 5mL로 1x 세척합니다.
- HBSS를 흡인하고 HBSS 10mL에 250μL의 5000 Units/mL 콜라겐분해효소 IV를 추가합니다. 37°C에서 45분 동안 배양합니다. 콜라겐분해효소 IV로 HBSS를 흡인하고 PBS 5mL로 한 번 세척합니다.
- PBS를 흡입하고 0.25% 트립신-EDTA 5mL를 추가합니다. 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 OP9 배지 4mL를 추가하고 피펫팅으로 세포층을 해리하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다.
- 100μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 흡인하고 10mL의 OP9 배지에 재현탁합니다.
- 새로운 젤라틴화된 10cm 세포 배양 페트리 접시에 플레이트 세포 현탁액(3.1.1 및 3.1.2 단계 참조). 37°C에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 부드러운 피펫팅으로 비부착성 세포를 수집합니다.
- 수집된 세포 현탁액을 100μm 세포 스트레이너를 통해 50mL 코니컬 튜브로 이동합니다. 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기. 상등액을 흡인하고 10mL의 분화 배지[5ng/mL 인간 줄기세포 인자(hSCF), 5ng/mL 인간 Flt3 리간드(hFLT3L) 및 5ng/mL 인간 인터루킨 7(hIL-7)이 포함된 OP9 배지]에 재현탁합니다.
- 셀 현탁액을 새로운 10cm OP9/DLL1 합류 접시에 플레이트합니다.
- 16일째에 세포를 통과시킵니다.
- 부드러운 피펫팅으로 비부착성 세포를 기계적으로 분리하고 100μm 세포 여과기를 통해 필터링합니다. 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 흡입하고 10mL 분화 배지에 재현탁합니다.
- 셀 현탁액을 새로운 10cm OP9/DLL1 합류 접시에 플레이트합니다.
- 그 후 3.8단계를 반복하여 5-7일마다 비부착성 세포를 계속 패시징합니다.
- 35일째에 CD4+CD8+ 이중 양성(DP) 집단을 농축하고 CD8αβ+ 단일 양성(SP) T 세포를 생성하도록 자극합니다(그림 2).
- 100μm 세포 스트레이너를 통해 부드럽게 피펫팅하고 필터링하여 비부착성 세포를 기계적으로 분리하여 덩어리를 제거합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 CD4 마그네틱 비드 분리를 통해 CD4+ 세포 집단을 강화합니다.
메모: CD4 마그네틱 비드를 사용하는 이유는 자극 후 CD4+CD8+ DP 세포를 직접 사멸시키는 것으로 입증된 CD4-CD8- 이중 음성(DN) 세포를 배양액에서 제거하는 것입니다.
- Neubauer 혈구계와 Trypan blue 염료를 사용하여 살아있는 CD4가 풍부한 세포를 계수합니다. OP9 배지에 0.5 x 106 cells/mL의 총 농도로 현탁합니다. 세포 현탁액 1mL를 조직 배양 평평한 바닥의 각 웰에 분취 OP9/DLL1 OP9/DLL1의 건강한 플레이트 24개.
- 100 IU 인간 인터루킨 2 (hIL-2), 5 ng/mL hIL-7, 500 ng/mL 항-인간 CD3 항체 및 2 μg/mL 항-인간 CD28 항체를 첨가한 다음 37 °C에서 배양합니다.
