유도 만능 줄기 세포에서 단일 양성 CD8 T 세포 생성

초록

출처: Good, M. L., et al. 종양 항원 특이적 T 세포 생성을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용합니다. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 종양 항원 특이적 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 CD8αβ+ T 세포를 생성하는 분석을 보여줍니다. 종양 항원 특이적 iPSC는 기질 세포 단층에서 성장하며 조혈전구세포(HPC)로 분화됩니다. HPC는 분화 배지를 사용하여 CD4+, CD8+, 이중 양성 T 세포로 분화됩니다. 그런 다음 이러한 세포를 자극하여 CD8을 발현하는 단일 양성 T 세포를 생성합니다.

프로토콜

1. 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서 인간 iPSC(hiPSC) 배양

참고: hiPSC를 배양하기 위한 대체 방법도 사용할 수 있으며, 여기에는 젤라틴, 젤라틴 단백질 혼합물, 재조합 라미닌 511 또는 hiPSC 확장에 사용되는 기타 세포 외 기질로 사전 코팅된 6웰 플레이트에 파종하는 것이 포함되나 이에 국한되지 않으며, 인간 만능 줄기 세포 배양을 위해 특별히 제조된 정의된 배지를 사용하여 배양할

수 있습니다.

1. MEF 배양
   1. 10cm 세포 배양 페트리 접시에 0.1% 젤라틴 4mL를 코팅하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
   2. 조사된 MEF 4 x 10⁶ 바이알을 37°C MEF 배지 10mL(Dulbecco's Modified Eagle Medium[DMEM] + 10% 소 태아 혈청(FBS) + 1x 페니실린-스트렙토마이신 + 1x L-글루타민 보충제)에 빠르게 해동합니다. 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 흡인하고 세포 펠렛을 9mL의 MEF 배지에 재현탁합니다.
   3. 인큐베이터에서 젤라틴으로 코팅된 ....

결과

그림 1: hiPSC 유래 조혈전구세포의 생성. (A) OP9/DLL1 공동 배양을 사용한 hiPSC와 조혈 계통의 분화에 대한 개략적 개요. (B) 1일(왼쪽 위), 3일(오른쪽 위), 7일(왼쪽 아래), 13일(오른쪽 아래)에 hiPSC 유래 구조의 출현. 스케일 바 = 100μm. (C) 13일째 hiPSC 유래 CD34+CD43+ 조혈전구세포의 유세포 분석. 데이터는 6개의 독립적인 실험(n = 1 대 2)을 나타냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 접시	코닝(Corning, Inc.)	353003
안티-CD3, 인간	BD 바이오사이언스	고양이# 561812, RRID:AB_1089628
안티 CD34, 인간	BD 바이오사이언스	고양이# 348791, RRID:AB_400381
안티-CD4, 인간	바이오레전드	고양이# 344612, RRID:AB_2028479
안티-CD43, 인간	BD 바이오사이언스	고양이# 560198, RRID:AB_1645460
안티-CD7, 인간	BD 바이오사이언스	고양이# 555361, RRID:AB_395764
안티-CD8a, 인간	BD 바이오사이언스	고양이# 555369, RRID:AB_398595
안티-CD8b, 인간	BD 바이오사이언스	고양이# 641057, RRID:AB_1645747
안티-TCRb, 인간	BD 바이오사이언스	고양이# 555548, RRID:AB_395932
CD28 인간 단클론 항체(15E8), 순수 기능 등급	밀테닐 바이오텍	Tel.: 130-093-375
CD3 인간 단클론 항체(OKT3), 순수 기능 등급	밀테닐 바이오텍	Tel.: 130-093-387
CD4 마이크로비즈, 인간	밀테닐 바이오텍	Tel.: 130-045-101
셀 스트레이너 100um	피셔 사이언티픽	제22-363-549
소 태아 세럼(FBS)	쌍둥이자리	100-500
Flt-3 리간드	R&D 시스템	427-플로리다
젤라틴 용액 2%	시그마-알드리치	G1393-100ML
글루타맥스(100배)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제35050-061	L-글루타민 보충제
HBSS Mg+Ca+ 페놀-레드 무함유	지브코	제14025-092
인터루킨-2	R&D 시스템	202-일리노이
인터루킨-7	R&D 시스템	407 밀리리터
iTAG MHC 테트라머 HLA-A*0201 Mart1 테트라머 -ELAGIGILTV	증권 시세	고양이#TB-0009-2
마트1-hiPSC	Vizcardo 외, 세포 줄기 세포 2013	리켄-IMS
멜란 - A, MART 1 (26-35)	이노펩	Tel.: 3146-0100
MEM 비필수 아미노산 용액	지브코	11140050
αMEM 분말	지브코	61100061
마우스 배아 섬유아세포(MEF)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	C57BL/6 MEF MIT 처리 각 4M; A34962
OP9/N-DLL1	리켄 생물자원센터	고양이# RCB2927; RRID:CVCL_B220	OP9/DLL1
페니실린/스트렙토마이신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15140-122
인산염 완충 식염수 pH 7.4 (1x)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제10010-023
영장류 ES 세포 배지	프로셀	RCHEMD001	인간 ESC 배양 배지
Rhok 억제제(Y-27632 디하이드로클로라이드)	토크리스	1254
RPMI 1640	지브코	11875093
줄기세포 인자(SCF)	R&D 시스템	455-엠씨
스템프로	이지 파사지	23181-010
T2-종양	증권 시세	T2 (174 x CEM. T2) (ATCC® CRL-1992™)
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제25300-062
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제25200-072
U 바닥 96웰 플레이트	코닝(Corning, Inc.)	3799

호 명 ) 호 호 표시기 ) 의 대답 ) 년 ) 호 년 년 년 표시기 ) 호 ) 호 년